BMP2及ACM對(duì)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的： 神經(jīng)干細(xì)胞具有不斷增殖和自我更新能力，并可以分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，能為中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能重建和神經(jīng)再生提供新的供體源，而且能較好地解決神經(jīng)移植治療的倫理道德及供體不足等問(wèn)題，為神經(jīng)系統(tǒng)的許多疾病如帕金森氏病的治療帶來(lái)了新希望。 室管膜前下區(qū)(Anterior subventriculorzone，SVza)是公認(rèn)的神經(jīng)干細(xì)胞富集區(qū)，該區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)背一腹信號(hào)控制下，不斷沿著一條局

2、限化的遷移通道一吻側(cè)遷移流(Rostral migratory stream, RMS)向嗅球(Olfactory bulb, OB)遷移，最后在嗅球分化為具有OB表型特征的中間神經(jīng)元，包括：多巴胺能神經(jīng)元和γ-氨基丁酸能神經(jīng)元。并且SVZa神經(jīng)干細(xì)胞除具有一般干細(xì)胞的自我更新能力和多分化潛能外，還具有以下特點(diǎn)：(1)自產(chǎn)生起即具備發(fā)育為神經(jīng)元的潛能；(2)能長(zhǎng)距離定向遷移；(3)在遷移過(guò)程中始終維持增殖狀態(tài)和神經(jīng)元分化潛能而不進(jìn)一步分

3、化。故SVZa神經(jīng)干細(xì)胞成為研究神經(jīng)干細(xì)胞增殖、遷移和分化的最佳模型。 神經(jīng)干細(xì)胞的分化主要取決于兩個(gè)方面：一是干細(xì)胞的內(nèi)在遺傳基因，二是干細(xì)胞所處的外部微環(huán)境。相同來(lái)源的干細(xì)胞處于不同的微環(huán)境中可以分化為不同類型不同譜系的細(xì)胞，因此目前對(duì)于干細(xì)胞分化的研究除了其自身基因的調(diào)控外，多側(cè)重于外來(lái)信號(hào)的調(diào)控。BMP2作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族成員，是干細(xì)胞所處局部微環(huán)境中非常重要的一種細(xì)胞因子。其在體外條件下對(duì)室管膜前

4、下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元作用如何還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。 另外，既往研究表明，單一因子誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元作用非常有限，這就要求探求多種因子聯(lián)合作用從而使分化為多巴胺能神經(jīng)元比例增加。ACM作為星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞外液，其內(nèi)含有膠質(zhì)細(xì)胞分泌的豐富的可溶性生物活性物質(zhì)，如：神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)等，且與神經(jīng)干細(xì)胞所處的體內(nèi)環(huán)境較為

5、接近，其促分化作用是單一神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子所無(wú)法比擬的。因此，本研究首先分離培養(yǎng)出SVZa神經(jīng)干細(xì)胞作為研究對(duì)象，然后再以不同濃度的BMP2誘導(dǎo)其分化，并分別檢測(cè)其分化為多巴胺能神經(jīng)元的比例。最后再以BMP2和ACM誘導(dǎo)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞分化，研究它們?cè)赟VZa神經(jīng)干細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元中的作用，希望為SVZa神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化研究提供一些實(shí)驗(yàn)資料。 方法： 1、運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)SVZa神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，并將收獲

6、的細(xì)胞克隆球行免疫細(xì)胞學(xué)的Nestin鑒定，然后將細(xì)胞克隆球分化后行NF、GFAP、CNP的免疫細(xì)胞學(xué)鑒定，以明確其具有干細(xì)胞特性和多分化潛能。 2、將體外培養(yǎng)所得的SVZa神經(jīng)干細(xì)胞，分別以0、0．1、1、10、20、100(ng/ml)濃度的BMP2誘導(dǎo)其分化，通過(guò)免疫組化和流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)不同濃度情況下SVZa神經(jīng)干細(xì)胞分化為TH+(酪氨酸羥化酶)神經(jīng)元的比例。 3、將體外培養(yǎng)所得的SVZa神經(jīng)干細(xì)胞，分為對(duì)照組

7、、BMP2組、ACM組、BMP2+ACM組分別予以誘導(dǎo)分化，通過(guò)免疫組化和流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)各組中SVZa神經(jīng)干細(xì)胞分化為TH+細(xì)胞的比例。 結(jié)果： 1、在體外無(wú)血清培養(yǎng)條件下，可以收獲大量懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆球，Nestin免疫細(xì)胞學(xué)反應(yīng)陽(yáng)性，分化后的NF、GFAP、CNP免疫細(xì)胞學(xué)反應(yīng)也呈陽(yáng)性反應(yīng)。 2、SVZa神經(jīng)干細(xì)胞分別以0、0．1、1、10、20、100(ng/ml)濃度的BMP2誘導(dǎo)分化后，經(jīng)檢測(cè)0．

8、1～100(ng/ml)組的TH+細(xì)胞比例均明顯高于0ng/ml組，10ng/ml組達(dá)最高峰，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)。 3、SVZa神經(jīng)干細(xì)胞分為對(duì)照組、BMP2組、ACM組、BMP2+ACM組誘導(dǎo)分化后，免疫組化和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果提示：各實(shí)驗(yàn)組的TH+細(xì)胞比例均明顯高于對(duì)照組，其中BMP2+ACM組分化比例最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05) 結(jié)論： 1、從孕16天Wistar大鼠SVZa