骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)中腦神經(jīng)干細(xì)胞分化的神經(jīng)元活性的研究.pdf

1、目的：自多潛能的神經(jīng)干細(xì)胞（Neural stem cells，NSCs）在成年小鼠紋狀體分離出來(lái)后，人們便開(kāi)始探索使用NSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可行性，發(fā)現(xiàn)體外擴(kuò)增的NSCs植入腦內(nèi)后，可在腦內(nèi)存活、遷移和分化，更重要的是分化于NSCs的神經(jīng)元能與周圍神經(jīng)元發(fā)生整合。因此NSCs移植正成為帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病極具有前景的治療手段。骨髓基質(zhì)細(xì)胞（Bone Marrow Stromal Cells，BMSCs）是一個(gè)多種細(xì)胞共存的多

2、潛能干細(xì)胞，受環(huán)境因素、激素、細(xì)胞因子等的調(diào)節(jié)，可在體內(nèi)外分化為內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。BMSCs表達(dá)多種細(xì)胞表面分子和分泌多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子以及細(xì)胞外基質(zhì)等，對(duì)造血干細(xì)胞的分化和發(fā)育起著決定性的作用。而調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子同樣也可調(diào)節(jié)中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，包括形態(tài)發(fā)生、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的分化、神經(jīng)遞質(zhì)/受體的表達(dá)、突起的生長(zhǎng)等。更重要的是造血干細(xì)胞和NP

3、Cs可表達(dá)很多共同基因，提示造血干細(xì)胞和NPCs存在類似的發(fā)育和分化機(jī)制。所以，BMSCs也應(yīng)具有調(diào)節(jié)NPCs發(fā)育和分化的能力。Kawasaki等發(fā)現(xiàn)BMSCs可誘導(dǎo)小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物胚胎干細(xì)胞（ES）分化為神經(jīng)干細(xì)胞NSCs，后者可分化為較高比例的神經(jīng)元和一定比例的多巴胺能神經(jīng)元，提示BMSCs可提供誘導(dǎo)ES分化為神經(jīng)細(xì)胞的信號(hào)。那么，BMSCs是否可直接調(diào)節(jié)NSCs的分化？在體外經(jīng)BMSCs條件液誘導(dǎo)分化來(lái)的這些神經(jīng)元是否同成熟神經(jīng)元

4、一樣具有神經(jīng)元的功能？本研究所獲得的信息將有助于探討NSCs的分化機(jī)制和推動(dòng)NSCs的應(yīng)用，為NSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 方法：分離培養(yǎng)BMSCs、新生大鼠中腦NSCs，實(shí)驗(yàn)分為3組：1對(duì)照組（Control）：2BMSCs共培養(yǎng)組（B-CC）；3BMSCs條件液組（B-CM）； Control組和B-CM組是將神經(jīng)球種植于預(yù)先包被PLL的35mm的培養(yǎng)皿中；則是將神經(jīng)球直接種于正常生長(zhǎng)的BMSCs表面。在神

5、經(jīng)球貼壁后Control組和B-CC組將液體更換為含2％B27的Neurobasal培養(yǎng)液，B-CM組換成BMSCs條件液。每3d換液一次。5d后進(jìn)行MAP-2免疫熒光染色，Hoechst33258復(fù)染胞核后，在倒置熒光顯微鏡下每孔隨機(jī)選擇20個(gè)不同的視野，使用CCD采樣計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占的比例。在此基礎(chǔ)上應(yīng)用BMSCs——CM誘導(dǎo)中腦NSCs分化為神經(jīng)元，免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法觀察NSCs分化的神經(jīng)元是否表達(dá)突觸體素（synaptoph

6、ysin），以及應(yīng)用熒光顯微數(shù)字成像系統(tǒng)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的改變，觀察分化的神經(jīng)元的電興奮性。將三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一起經(jīng)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，進(jìn)行顯著性分析。
　　 結(jié)果：分離培養(yǎng)BMSCs，BMSCs細(xì)胞的形狀接近于成纖維細(xì)胞。部分細(xì)胞平行排列，使用CD71抗原進(jìn)行免疫化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞99％為CD71抗原陽(yáng)性。分離培養(yǎng)NSCs培養(yǎng)24 h后，出現(xiàn)2～4個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞球。隨后細(xì)胞開(kāi)始聚集形成球狀懸浮生長(zhǎng)，球狀的NSCs隨培養(yǎng)天

7、數(shù)增加逐漸增大，形成直徑50～300個(gè)細(xì)胞的大小不等的NSCs球。神經(jīng)球內(nèi)的細(xì)胞為nestin陽(yáng)性。將其貼壁進(jìn)行自然分化，發(fā)現(xiàn)可以分化為神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，用BMSCs、B-CM進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)較自然對(duì)照組比較，在B-CC組、B-CM組，NSCs分化的神經(jīng)元比例分別為（36.81±10.17％）、（37.34±8.43％），較對(duì)照組明顯增多。在此基礎(chǔ)上利用免疫熒光探針技術(shù)，熒光顯微數(shù)字成像系統(tǒng)對(duì)Fura-2熒光進(jìn)行采集，熒

8、光圖像經(jīng)過(guò)Mata Flour軟件進(jìn)行分析，計(jì)算出平均熒光強(qiáng)度隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化的曲線。細(xì)胞在靜狀態(tài)時(shí)熒光比值維持較低水平，分別給予KCl（55mmol/L）、谷氨酸（100mmol/L）后，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，細(xì)胞鈣內(nèi)流。在BMSCs條件液誘導(dǎo)中腦NSCs分化的神經(jīng)元分化后3d，7d和9d時(shí)進(jìn)行突觸素免疫熒光染色，未見(jiàn)明顯的突觸素表達(dá)。至12d時(shí)可見(jiàn)突觸素表達(dá)，但熒光信號(hào)相對(duì)較弱，觀察不到串珠樣分布的熒光信號(hào)。至18d時(shí)，鏡下可見(jiàn)明亮熒光信

9、號(hào)，呈串珠狀排列在神經(jīng)元的突起上。
　　 結(jié)論：本研究證實(shí)：1.NSCs具有增殖的特性，自然狀態(tài)下可以分化為神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞；2.BMSCs可以誘導(dǎo)NSCs分化的神經(jīng)元的比例增多，星形膠質(zhì)細(xì)胞比例減少；3.B-CM與BMSCs具有同樣的作用，能夠誘導(dǎo)NSCs分化的神經(jīng)元的比例增多，星形膠質(zhì)細(xì)胞比例減少；4.B-CM誘導(dǎo)NSCs分化的神經(jīng)元能夠在KCl和谷氨酸的刺激下打開(kāi)鈣通道，鈣離子內(nèi)流，具有電興奮性的基礎(chǔ)；5