人端粒酶逆轉錄酶啟動子驅動重組腺病毒治療人前列腺癌的動物實驗研究.pdf

1、目的：前列腺癌在歐美國家中發(fā)病率很高，死亡率居第二位，儀次于肺癌。我國前列腺癌的發(fā)病率也在逐年升高。盡管絕大多數(shù)局部浸潤和遠處轉移前列腺癌，初始對雄激素撤除有效，但最終預后不佳，而導致治療失敗。近年來隨著分子機制研究的深入，基因療法為前列腺癌尤其是那些雄激素非依賴性前列腺癌的治療提供一條新途徑。自殺基因治療是一種有前景的基因治療方法，常用的為單純皰疹病毒胸苷激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase，HS

2、V-tk)基因。其機理為基因編碼的胸腺嘧啶核苷激酶將無毒的環(huán)氧鳥苷(gancyclovir，GCV)磷酸化，干擾腫瘤細胞DNA的合成，從而導致細胞死亡。然而缺乏殺傷腫瘤特異性，是現(xiàn)今許多基因治療方案所面臨的一個共同問題，因此研發(fā)出具有腫瘤靶向機制的治療方法顯得非常必要。端粒酶在大多惡性腫瘤細胞中處于激活狀態(tài)而在正常細胞中卻沒有活性或者活性很低，是目前所報道最為廣譜的腫瘤生物分子標記。人端粒酶逆轉錄酶(humantelomerasetra

3、nscriptase，hTERT)是維持端粒酶活性所必需的催化亞單位，它的表達調控在轉錄水平上。利用hTERT啟動子來調控病毒攜帶的目的基因，可使病毒選擇性的在端粒酶陽性的腫瘤細胞中表達目的基因。本實驗目的是通過腺病毒載體嵌入hTERT啟動子介導的HSV-tk基因，重組構建Ad-hTERT-HSV-tk，結合應用GCV，對裸鼠移植性前列腺癌進行治療，從而將HSV-tk基因選擇性地導入前列腺癌細胞，并能把GCV轉化為毒性代謝物——三磷酸丙

4、氧鳥苷，其作為鏈的終止劑，干擾細胞分裂時DNA的合成，最終導致前列腺癌細胞阻抑或死亡而對正常細胞沒有影響。從而體現(xiàn)該治療系統(tǒng)的安全性、有效性以及靶向性。 方法：于裸鼠右前背部皮下接種5×107個/mlLNCaP細胞懸液0.1m1，建立人前列腺癌裸鼠移植瘤模型。待成瘤約50mm3后，將荷瘤裸鼠隨機分為4組，每組10只。分組以及給藥方式如下：A組，空白對照，不給藥；B組，Ad-hTERT-HSV-tk對照組，經(jīng)尾靜脈注射5.0×10

5、9Pfu/ml重組腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk0.1ml，第1，5，10天各1次，第2～15天腹腔注射PBS0.1ml；C組，GCV對照組，經(jīng)尾靜脈注射PBS0.1ml，第1，5，10天各1次，第2～15天腹腔注射GCV50mg/kg；D組，治療組，經(jīng)尾靜脈注射Ad-hTERT-HSV-tk同B組，腹腔注射GCV同C組。觀察腫瘤體積、重量、抑制率、體積-時間曲線以及裸鼠生存期。實驗結束后，取前列腺腫瘤組織制備石蠟切片進行HE染色

6、，應用流式細胞學法、TUNEL法及透射電鏡檢查檢測腫瘤細胞凋亡，免疫組化染色檢測增殖細胞核抗原，測定增殖指數(shù)。 結果：在作用底物GCV存在條件下，Ad-hTERT-HSV-tk對裸鼠移植瘤具有明顯抑制作用，在整個觀察期內，Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治療組的腫瘤體積均明顯小于對照組(P＜0.05)，對照組各組之間相比無顯著性差異；比較切除腫瘤標本的重量，可發(fā)現(xiàn)Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治療組的移植瘤重量明顯

7、輕于對照組(P=0.000137)，也明顯輕于Ad-hTERT-HSV-tk和GCV治療組(P值分別為0.000338和0.000467)；病理檢查發(fā)現(xiàn)Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治療組的腫瘤細胞稀疏分散排列，腫瘤血管明顯減少，組織結構紊亂，多為纖維組織所代替，呈退化表現(xiàn)。治療結束后，取心、肺、肝組織進行形態(tài)學觀察，與正常對照的心、肺、肝組織相比無顯著差別；Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治療組流式細胞學法測得的細胞周期

8、中G1/S期細胞數(shù)平均占84％，明顯高于對照組，而G2/M期細胞卻明顯低于對照組，流式細胞技術及TUNEL法測定治療組的凋亡率明顯高于對照組(P＜0.05)，透射電鏡可檢測到腫瘤細胞凋亡，另外免疫組化法測定的增殖指數(shù)，治療組明顯低于對照組(P＜0.05)。 結論：Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系統(tǒng)能夠明顯抑制裸鼠前列腺癌移植瘤的生長，治療組裸鼠的腫瘤生長速率明顯慢于對照組，具有明顯的量-效曲線，而且裸鼠的生存期顯著延長。