生物工程材料介導的成體干細胞移植治療大鼠腦損傷修復的實驗研究.pdf

1、外傷性腦損傷是全球性的多發(fā)性傷病,也是死亡率和致殘率最高的傷病之一,并且會造成嚴重的家庭和社會經(jīng)濟負擔。促進顱腦損傷后神經(jīng)修復與再生是當前研究的熱點和難點。
　　 腦的自我修復能力有限,存在于腦組織中的內(nèi)源性干/祖細胞對損傷的應答,產(chǎn)生新的有功能的細胞能力有限,而且受損的中樞內(nèi)微環(huán)境也不適合神經(jīng)組織的再生,因此治療腦損傷的策略在于改善損傷局部的微環(huán)境,使其適于神經(jīng)組織的修復,同時移植入外源性細胞替代失去功能或死亡的細胞,并與宿主

2、細胞形成具有功能的整合,改善神經(jīng)行為缺陷。
　　 受損傷腦組織的功能重建與局部血管網(wǎng)的重建、改善新陳代謝環(huán)境也關系密切。目前認為,成體新血管的形成過程是血管生成和血管發(fā)生兩個過程的復合,血管生成是毛細血管從膨大的小血管側(cè)長出的過程；而血管發(fā)生是通過血管內(nèi)皮祖細胞(endothelia progenitor cell,EPCs)原位形成血管。當腦組織受損缺失時,組織空洞中移植入的神經(jīng)干細胞在沒有血管形成的情況下,僅依賴損傷周邊區(qū)域

3、的血管生成,無法得到生存所需的充足養(yǎng)分,如果有EPCs作為血管發(fā)生的原基而原位形成血管、則會大大有利于受損傷腦組織的結(jié)構(gòu)與功能修復。當前的大部分腦損傷干細胞移植研究都缺乏對此問題的考慮,也由此導致移植入的細胞生存率很低。本實驗擬通過移植入EPCs,結(jié)合生物工程材料的方式,促進腦損傷的組織空洞中血管網(wǎng)的重建。移植入的EPCs將充當新血管形成的底物,并且運用旁分泌的方式促進血管生成。
　　 神經(jīng)干細胞(neural stem cel

4、ls,NSCs)具有自我增殖和分化能力,能夠分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞等,可以用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后移植替代失去功能或死亡的細胞,移植入的細胞分化的神經(jīng)元能與宿主細胞形成具有功能的整合,改善和恢復缺失的神經(jīng)功能,移植入的細胞分化的星形膠質(zhì)細胞可以通過產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)改善損傷局部的微環(huán)境,并且為移植入的神經(jīng)元和損傷局部遷移再生的神經(jīng)元提供物理支撐,使其適于神經(jīng)組織的修復,而移植入的細胞分化的少突膠質(zhì)細胞可能參與損傷局部的免疫

5、反應。
　　 目前生物工程材料已經(jīng)廣泛使用在皮膚、骨骼、軟骨、血管、外周神經(jīng)及脊髓等組織缺損的再造和修復。組織工程策略目的在于提供種子細胞粘附的支架。本課題擬采用的生物工程水凝膠材料為移植物的基質(zhì)材料,其優(yōu)勢在于可注射性,便于移植操作,自動塑性,適應性強,適用范圍廣。
　　 本實驗擬在采用控制性腦皮質(zhì)撞擊(controlled cortical impact,CCI)制作標準化的中度腦損傷模型的基礎上,應用成體來源NSC

6、s、EPCs聯(lián)合生物工程水凝膠材料進行腦損傷空腔內(nèi)移植,以期能夠替代損傷缺失的腦組織細胞,并且建立新的功能聯(lián)系,恢復受損的神經(jīng)功能。
　　 目的:獲取并體外擴增成年大鼠骨髓基質(zhì)細胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)、脂肪來源干細胞(adipose tissue derived stem cells,ADSCs),并分別向神經(jīng)干細胞(neural stem cells,NSCs)及血管內(nèi)皮祖細胞(e

7、ndothclial progenitorcells,EPCs)方向誘導分化,分別檢測其表型及功能,對比不同來源細胞的差異。
　　 方法:取大鼠股骨、脛骨骨髓,密度梯度法分離獲取BMSCs。取大鼠腰部白色脂肪組織,Ⅰ型膠原酶消化法獲取血管基質(zhì)片,運用“DMEM/F12+10％胎牛血清(FBS)”擴增ADSCs。運用堿性成纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)和N2等誘導成NSCs,運用“低糖DMEM培養(yǎng)液+10-8mo

8、l/L地塞米松+5％FBS+20ng/mL,血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)+5ng/mL bFGF+5ng/mL胰島素樣生長因子(IGF)”配方的分化培養(yǎng)液誘導成EPCs。免疫熒光細胞化學和流式細胞術(shù)鑒定間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)、NSCs、EPCs的表面特征抗原。細胞計數(shù)檢測細胞增殖能力。通過乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)攝取和墨汁吞噬試驗、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA表達檢測、

9、體外血管生成實驗等細胞功能方面檢測進一步確認誘導出的EPCs是否具有生理功能。
　　 結(jié)果:體外可成功擴增大鼠成體來源BMSCs和ADSCs,細胞呈長梭形,以ADSCs胞體更長,細胞排列更具方向性。BMSCs和ADSCs均能成功誘導出Nestin陽性的NSCs,并且在適當培養(yǎng)條件可以進一步誘導分化為GFAP、Neun陽性細胞。通過本實驗設計誘導方案可成功將BMSCs和ADSCs誘導為EPCs,細胞表型CD34-、CD133+、血

10、管假性血友病因子(vWF)+和Flk-1+,并且兩種來源的EPCs增殖能力無差異。兩種細胞來源的EPCs均能攝取Ac-LDL而不吞噬墨汁,eNOS的表達也與成熟的內(nèi)皮細胞無差異,并且具有體外血管生成能力。
　　 結(jié)論:MSCs能夠分離自大鼠成體骨髓和脂肪組織。它們均具有較強增殖能力并且能夠被誘導分化為NSCs和EPCs。誘導得到的EPCs是具有生理功能的細胞。
　　 目的:體外檢測培養(yǎng)細胞與生物工程水凝膠材料的相互影響,

11、為體外培養(yǎng)細胞與生物工程水凝膠共移植治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:選擇兩款不同組分的水凝膠Matrigel和PuraMatrix作為實驗材料,以前述方法獲得的EPCs作為檢測細胞,將EPCs培養(yǎng)于不同濃度的Matrigel(10％、20％、30％)或PuraMatrix(0.25％、0.5％、1％)表面,或與不同濃度的Matrigel或PuraMatrix混懸培養(yǎng),于培養(yǎng)的不同時間觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài),并用Alamar Blue

12、法檢測細胞的增殖情況,以確定材料的細胞毒性。觀察EPCs在水凝膠中的成管化狀態(tài),以檢測細胞是否仍具有生理功能。將前述方法獲得的NSCs與最佳濃度的水凝膠共培養(yǎng)觀察細胞的生長情況,用免疫細胞化學法檢測其分化情況。
　　 結(jié)果:三種濃度Matrigel中30％的Matrigel細胞毒性較大,而三種濃度的PuraMatrix中1％的PuraMatrix細胞毒性較大。EPCs培養(yǎng)于Matrigel表面較混懸其中的細胞增殖率高,而且此差異

13、隨Matrigel的濃度增高而增強。EPCs在20％和30％的Matrigel表面培養(yǎng)均能成管化,在10％的Matrigel表面和混懸其中培養(yǎng)7天,多數(shù)細胞沉底。20％的Matrigel中培養(yǎng)7天能夠立體成管化。而30％的Matrigel中,EPCs僅能伸出少數(shù)突起,不能成管化。PuraMatrix在0.25％和0.5％的濃度時,EPCs培養(yǎng)于PuraMatrix表面與細胞混懸其中的細胞增殖率相比無明顯差異；而在1％時EPCs培養(yǎng)于Pu

14、raMatrix表面和混懸其中存活率均很低。EPCs在0.25％和0.5％的PuraMatrix表面培養(yǎng),細胞能夠穿入PuraMatrix中。而在0.25％的PuraMatrix中培養(yǎng)細胞可附著于材料上,但較難成管化,0.5％的PuraMatrix中培養(yǎng)7天能夠成管化。三種細胞密度相比,107個/mL的細胞密度EPCs更容易體外成管化。NSCs在水凝膠中能夠遷移分化,并且0.5％PuraMatrix較20％Matrigel中細胞向神經(jīng)元

15、樣細胞分化比例較高。
　　 結(jié)論:Matrigel和PuraMatrix在適當?shù)臐舛?20％Matrigel和0.5％PuraMatrix)均能與培養(yǎng)細胞良好的相容,并且起到支撐作用,模擬正常生理狀態(tài),給細胞提供一個三維生長環(huán)境,并且能夠促進NSCs細胞分化。由于PuraMatrix為人工合成肽產(chǎn)物,降解產(chǎn)物無毒性,可能是更適合移植的生物材料。
　　 目的:觀察體外擴增的干、祖細胞及生物工程水凝膠材料共同移植對腦損傷后的

16、神經(jīng)功能恢復的影響。
　　 方法:健康成年Wistar近交系大鼠隨機分為正常對照組、假手術(shù)組、生理鹽水移植組、單純水凝膠移植組、EPCs聯(lián)合水凝膠移植組、NSCs聯(lián)合水凝膠移植組、NSCs和EPCs聯(lián)合水凝膠移植組。采用改良自由落體撞擊腦損傷模型,損傷7天時于原損傷區(qū)行移植術(shù),分別于動物造模成功后6天、移植術(shù)后1、2、3、4周進行肢體運用不對稱試驗、運動評價,移植術(shù)后30天行水迷宮實驗。移植35天處死實驗動物,完整取腦常規(guī)石蠟固

17、定,包含損傷灶的腦組織行連續(xù)冠狀位切片。HE染色后計算損傷所致空腔體積,分析各組損傷恢復情況。FITC-dextran灌注觀察損傷局部血管分布情況。免疫組織熒光化學法染色,分析移植細胞的存活和遷移情況,以及損傷灶局部組織修復的病理改變。
　　 結(jié)論:體外擴增NSCs、EPCs及生物工程水凝膠材料共移植有促進局灶性腦外傷大鼠神經(jīng)功能恢復的作用,其中生物工程水凝膠材料能夠為移植細胞提供物理支持和攀附支架,EPCs能夠參與損傷局部的血