蛋白質指紋圖譜和生物信息學在大腸癌中的臨床應用研究.pdf

1、大腸癌在世界范圍是第三大常見惡性腫瘤,在發(fā)達國家占第二位.近年來,我國大腸癌死亡率在大城市位居第四位,在農村位居第五位,而且發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢,發(fā)病年齡明顯提前.過去50年來大腸癌根治術后生存率無明顯變化,50﹪患者術后因局部復發(fā)或轉移而最終死亡.死因與分期較晚和是否合理選擇治療方法有直接關聯. 表面加強激光解吸電離.飛行時間質譜(surface-enhanced laser desorption/ionization

2、 time-ofoflight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)是近年來發(fā)展起來的一種全新的蛋白質組學研究手段,該方法相比其他傳統(tǒng)蛋白質組學研究方法,具有能夠直接對臨床標本進行檢測,實現了質譜技術高通量的用于臨床樣本檢測的優(yōu)點.生命科學的迅猛發(fā)展使人們從基因組學、蛋白質組學等研究領域中收獲了大量的數據,僅僅依靠傳統(tǒng)的數理統(tǒng)計手段是很難勝任的,生物信息學的發(fā)展為收集、存儲、分析其數據,并從中獲取有用的生物學信

3、息提供了重要的手段.課題旨在應用SELDI蛋白質指紋圖譜和生物信息學技術從血清中篩選大腸癌蛋白質腫瘤標志物并構建術前分期檢測模型;尋找術后監(jiān)測差異蛋白;構建術后肝轉移檢測模型;建立組織蛋白質指紋圖譜的檢測方法從而尋找大腸癌/正常大腸組織間的差異表達蛋白質.以期找到適合大腸癌術前分期、術后復發(fā)轉移監(jiān)測的候選腫瘤標志物,尋找組織特異性差異表達蛋白,為探索大腸癌發(fā)病機制提供新思路. 第一部分 血清蛋白質指紋圖譜在大腸癌術前分期中的研究

4、 采用SELDI-TOF-MS技術及其配套CM10蛋白質芯片檢測76例術前大腸癌患者(按UICCl997 TNM分期標準,其中Ⅰ期10例,Ⅰ期19例,Ⅲ期16例,Ⅳ期31例)的血清蛋白質指紋圖譜,Mann-WhitneY秩檢驗比較各組血清蛋白質質譜數據,尋找各組之間表達有差異的蛋白質峰.大腸癌各期患者術前血清蛋白質質譜比較的數據導入Matlab6.5數據處理軟件的SVM、判別分析軟件.選擇兩組間差別最顯著的10個蛋白質峰數據進行

5、分析.篩選出Youden指數最高的秩和比峰組合,用SVM留一法和判別分析留一法建立分期模型.最后同時輸出SVM、原始判別及二者交叉驗證的結果,并應用時間序列分析的方法將Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ, Ⅳ各期以二維散點圖的形式表示.最后選用判別分析留一法,并應用時間序列分析的方法將Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ, Ⅳ各期以二維散點圖的形式表示.6個蛋白質峰[2760、2965、2048、4796、4140和37762質荷比(m/z)]組合所構建的診斷模型I鑒別局限性大腸癌(Ⅰ

6、、Ⅱ期)和區(qū)域性(Ⅲ期)大腸癌患者的總準確率86.67﹪(39/45);3個蛋白質峰[6885、2058和8568質荷比(m/z)]組合所構建的診斷模型Ⅱ鑒別局限區(qū)域性(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)和系統(tǒng)性大腸癌患者(Ⅳ期)的總準確率75.00﹪(57/76).診斷模型Ⅲ鑒別Ⅰ期和Ⅱ期大腸癌患者的準確率86.21﹪(25/29);模型Ⅳ鑒別Ⅰ期和Ⅲ期大腸癌的準確率84.62﹪(22/26);模型Ⅴ鑒別Ⅱ期和Ⅲ期大腸癌的準確率85.71﹪(30/35)

7、;模型Ⅵ鑒別Ⅱ期和Ⅳ期大腸癌的準確率80.00﹪(40/50);模型Ⅶ鑒別Ⅲ期和Ⅳ期大腸癌患者的總準確率78.72﹪(37/47).Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ各期的二維散點圖,可以明顯看出各期之間的區(qū)別.該方法可以較好地應用于大腸癌的術前分期:該方法所篩選的候選腫瘤標志物可以指導大腸癌綜合治療. 第二部分 血清蛋白質指紋圖譜在大腸癌術后隨訪中的研究 隨訪72例術后大腸癌患者,完成其血清蛋白質指紋圖譜的檢測.初步分析血清蛋白質指紋圖譜

8、在大腸癌術后監(jiān)測早期發(fā)現復發(fā)或轉移病灶中的價值.大腸癌術后患者共72例,無復發(fā)、轉移者30例,有復發(fā)、轉移者42例,隨訪時間:2002年4月至2005年4月.中位隨訪時間16個月.檢測該76例血清的蛋白質指紋圖譜,用Biomarker Wizard 3.2.0軟件比較其蛋白質指紋圖譜,得到11個蛋白質峰的表達差異有統(tǒng)計學意義,其中有6個蛋白質峰(44888、5908、28092、5341、2957和8566m/z)在大腸癌術后復發(fā)轉移中

9、表達低于無復發(fā)轉移的患者(P<0.05),5個蛋白質峰(2107、6114、2131、2162和2389m/z)在大腸癌術后復發(fā)轉移中表達高于無復發(fā)轉移的患者(p<0.05);應用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進一步計算這11個表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)的蛋白質峰的ROC曲線下面積(AUC),結果其中2個峰(44888和5908 m/z)的AUC值大于0.07.所篩選出的差異蛋白質峰,對于臨床指導監(jiān)測大腸癌術后復發(fā)轉移,具有一定意義

10、. 第三部分 血清蛋白質指紋圖譜在大腸癌術后監(jiān)測肝轉移中的應用 在42例大腸癌術后有復發(fā)轉移的病人中,19例僅有肝轉移、7例肝轉移伴其余部位轉移、16例無肝轉移但有其余部位轉移以及30例術后無復發(fā)轉移患者.分析其血清蛋白質指紋圖譜,應用支持向量機留一法篩選出監(jiān)測大腸癌肝轉移的候選標志物,篩選出4個蛋白質峰[6199,5482,9295和2872質荷比(m/z)]組合所構建的模型1鑒別大腸癌單獨肝轉移患者及肝轉移伴其余部位

11、轉移患者總準確率92.31﹪(24/26);4個蛋白質峰[6199,3419,2399和2127質荷比(m/z)]組合所構建的模型2鑒別大腸癌單獨肝轉移患者和有其余部位轉移患者的總準確率83.33﹪(35/42):4個蛋白質峰[2208,2299,2355和2758質荷比(m/z)]組合所構建的模型3鑒別大腸癌術后無復發(fā)轉移和單獨肝轉移的總準確率87.76﹪(43/49). M/Z為6199的蛋白質在大腸癌肝轉移組中的豐度明顯高于其余部

12、位轉移者(P<0.05),可以用來監(jiān)測患者轉移部位.2208,2299,2355和2758在大腸癌肝轉移后其豐度明顯高于無瘤生存組,提示可能是與大腸癌術后肝轉移相關的標記物. 結論: 一、應用血清蛋白質指紋圖譜縝密鑒別大腸癌術前分期 1.6個蛋白質峰[2760、2965、2048、4796、4140和37762質荷比(m/z)]組合所構建的診斷模型Ⅰ鑒別局限性大腸癌(Ⅰ、Ⅱ期)和區(qū)域性(Ⅲ期)大腸癌患者的總準確率

13、86.67﹪(39/45). 2.3個蛋白質峰[6885、2058和8568質荷比(m/z)]組合所構建的診斷模型Ⅱ鑒別局限區(qū)域性(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期)和系統(tǒng)性大腸癌患者(Ⅳ期)的總準確率75.00﹪(57/76). 3.診斷模型Ⅲ鑒別Ⅰ期和Ⅱ期大腸癌患者的準確率86.21﹪(25/29);模型Ⅳ鑒別Ⅰ期和Ⅲ期大腸癌的準確率84.62﹪(22/26);模型Ⅴ鑒別Ⅱ期和Ⅲ期大腸癌的準確率85.71﹪(30/35);模型Ⅵ鑒別Ⅱ期

14、和Ⅳ期大腸癌的準確率80.00﹪(40/50);模型Ⅶ鑒別Ⅲ期和Ⅳ期大腸癌患者的總準確率78.72﹪(37/47). 4. Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ各期的二維散點圖,可以明顯看出各期之間的區(qū)別. 二、應用血清蛋白質指紋圖譜篩選出大腸癌術后復發(fā)轉移的候選標志物 1.得到11個蛋白質峰的表達差異有統(tǒng)計學意義 2.其中有6個蛋白質峰(44888、5908、28092、5341、2957和8566m/z)在大腸癌術后復發(fā)

15、轉移中表達低于無復發(fā)轉移的患者(JF)<0.05),5個蛋白質峰(2107、6114、2131、2162和2389m/z)在大腸癌術后復發(fā)轉移中表達高于無復發(fā)轉移的患者(P<0.05).3. 進一步計算這11個表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)的蛋白質峰的ROC曲線下面積(AUC),結果其中2個峰(44888和5908 m/z)的AUC值大于0.07. 三、應用血清蛋白質指紋圖譜鑒別大腸癌根治術后肝轉移 1.篩選出4

16、個蛋白質峰[6199,5482,9295和2872質荷比(m/z)1組合所構建的模型1鑒別大腸癌單獨肝轉移患者及肝轉移伴其余部位轉移患者總準確率92.31﹪(24/26). 2.篩選出4個蛋白質峰[6199,3419,2399和2127質荷比(m/z)]組合所構建的模型2鑒別大腸癌單獨肝轉移患者和有其余部位轉移患者的總準確率83.33﹪(35/42). 3.篩選出4個蛋白質峰[2208,2299,2355和2758質荷比