血清蛋白質(zhì)指紋圖譜在甲狀腺癌診斷的臨床應用研究.pdf

1、甲狀腺癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的1％，它也是內(nèi)分泌腫瘤中最常見的惡性腫瘤，占內(nèi)分泌惡性腫瘤的91.5％，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢。按腫瘤的病理類型，甲狀腺癌可分為乳頭狀癌、濾泡狀癌、未分化癌、髓樣癌，其中分化型癌占80-90％，早期予以手術治療，5年生存率高達75％以上，所以甲狀腺癌早期診斷具有重要意義。目前，臨床上甲狀腺癌的診斷使用超聲、CT、MRI、核素掃描、細針穿刺細胞學檢查等多種手段，但我國甲狀腺癌術前誤診率仍

2、高達40-77％。長期以來，醫(yī)學界一直尋求對甲狀腺癌診斷有臨床意義的標記物，發(fā)現(xiàn)半乳糖凝集素，包殼素(involucrin)，甲狀腺過氧化物酶(TPO)，白細胞抗原單克隆抗體系統(tǒng)(CD)，癌胚纖維連結蛋白等，但是這些標記物只是對某一病理類型的甲狀腺癌敏感，限制了其在臨床的實際應用。因此，尋找理想的生物標記物，探索和建立一種簡單、快速、敏感性高和特異性強的甲狀腺癌早期診斷技術已經(jīng)成了臨床醫(yī)學上的迫切需要。 蛋白組學應用大規(guī)模蛋白質(zhì)

3、分離識別技術，立體、全面地對基因組所表達的整套蛋白質(zhì)進行分析，從細胞整體水平進行蛋白質(zhì)屬性的研究，它的飛速發(fā)展為腫瘤的研究提供了新的思維和技術平臺。 甲狀腺癌的發(fā)生是多基因多階段多因素的動力學過程，是癌基因激活和抑癌基因失活的結果，而從功能的角度看，由于運載信息、介導信息流動的媒介是蛋白質(zhì)而不是基因，它是一種蛋白質(zhì)組性疾病，在其出現(xiàn)病理變化之前，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)在成分和數(shù)量上都會有相應的改變，通過對蛋白質(zhì)的動態(tài)觀察可以篩選出疾病早

4、期的指標和征兆。同時鑒于甲狀腺癌發(fā)生演變因素的復雜性，監(jiān)測單一或數(shù)個指標對甲狀腺癌進行早期診斷不可避免的存在敏感性和特異性矛盾。蛋白組學技術可以高通量的篩選腫瘤不同發(fā)展階段基因表達的各種蛋白質(zhì)，或通過正常人、相關疾病及腫瘤患者的體液在蛋白質(zhì)種類和數(shù)量上的差異比較，從而發(fā)現(xiàn)大量有診斷價值的蛋白質(zhì)分子，確定和篩選特異的腫瘤標志物。表面增強激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜技術(Surface Enhanced Laser。Desorption/Io

5、nizayion Time of Flight-Mass Spectrometry， SELDI-TOF-MS)，是2002年開發(fā)的新型蛋白組學技術，應用基因芯片的設計原理，把層析、質(zhì)譜等技術合理地與蛋白芯片結合，可檢測出傳統(tǒng)方法難以鑒定的蛋白質(zhì)和多肽，具有快速、靈敏、高通量等特點，被用在卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、結腸癌等腫瘤標記物的研究中，有重大的突破。我們利用SELDI-TOF-Ms技術檢測甲狀腺癌患者、甲狀腺良性結節(jié)患

6、者和正常人的血清蛋白質(zhì)組圖譜并結合生物信息學方法，篩選特異的標記物，探討建立可用于甲狀腺癌早期診斷和術前定性診斷的血清蛋白質(zhì)指紋圖譜模型。 材料與方法 1．材料 1.1標本 108例血清：甲狀腺癌40例(Ⅰ -Ⅱ期26例，Ⅲ-Ⅳ期14例)，甲狀腺良性結節(jié)36例(甲狀腺腺瘤例、結節(jié)性甲狀腺腫例)，健康對照組32例。所有甲狀腺癌和甲狀腺良性結節(jié)標本均經(jīng)2位病理學家證實。甲狀腺癌中男9例，女31例，平均年齡41歲。

7、 1．2設備表面增強激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜技術(SurfaceEnhanced Laser Desorption/Ionizayion Time of Flight-Mass Spectrometry，SELDI-TOF-MS)，(PBS Ⅱ<'+> Ciphergen Inc．美國)。主要參數(shù)：收集范圍為1000-50000；優(yōu)化范圍為2000-30000。 1．3芯片 WCX<,2>為弱陽離子結合芯片。 1．

8、4應用軟件和標志物評價指標：應用軟件：Ciphergen Software 3.1和Biomarker Wizard；支持向量機(SW)：ZUCI-ProteinChip Data Analyze System軟件包。評價實驗的指標：靈敏度、特異度、Youden指數(shù)。 2．方法 2．1血清樣本處理：U9溶液處理血清，50mNaNC(pH=4)稀釋，Bioprocessor(可含12根芯片)結合反應60分鐘，上述NaNC(

9、pH=4)緩沖液清洗芯片，取出芯片風干后點50％飽和的SPA溶液，上機讀片。 2．2 SELDI操作： 原始數(shù)據(jù)先用Proteinchip Software 3.1做校正，總離子強度及分子量的均一化；再用Biomarker Wizard和ZUCI-ProtelnChip Data Analyze System軟件包中的離散小波過濾噪音，得到初步篩選結果；對初步篩選出來的質(zhì)荷比峰做個組別數(shù)據(jù)Wilconxon秩和檢驗，按照

10、P值得大小比較每一個質(zhì)荷比峰在甲狀腺癌與對照中表達差異的顯著性程度。 2．3血清樣本分組： 組1：甲狀腺癌(40)和健康對照(32)組2：甲狀腺癌(40)和甲狀腺良性結節(jié)(36)組3：Ⅰ-Ⅱ期甲狀腺癌(26)和Ⅲ-Ⅳ期甲狀腺癌(14)。 2．4建模方法： 2．4．1初步篩選每組有統(tǒng)計學差異的m/z。 2．4．2生物信息學軟件分析數(shù)據(jù)，用訓練集建立判別模型，用測試集檢驗模型的效力，進一步篩選用于建模

11、的m/z。 2．4．3評價各模型測試集的敏感性、特異性、準確率、陽性預測值和陰性預測值。 結果 1．甲狀腺癌組與正常人組的比較： 甲狀腺癌組與正常人組質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過初步篩選得到347個M/Z峰，其相對強度做Wilconxon秩和檢驗分析得到46個P值小于0.01的M/Z峰，從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預測值的youden指數(shù)最高的組合模型，得到3個m/z位于6651、6452、6984的

12、標志物，在甲狀腺癌低表達，在正常人高表達。聯(lián)合3個潛在標記物作為輸入值，留一法交叉檢測，在測試集上甲狀腺癌篩查模型的特異性為80％，敏感度為87.5％。 對15例未知血清標本應用已確定的方法測定血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜，將每例血清蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)導入已建立的支持向量機模型進行預測，8例甲狀腺癌中有8例，7例正常對照中有6例被正確預測；得出該模型的特異性為86％，敏感性為100％。 2．甲狀腺癌組與甲狀腺良性結節(jié)組的比較： 甲

13、狀腺癌組和甲狀腺良性結節(jié)組初步篩選出347個M/Z峰，經(jīng)Wilconxon秩和檢驗分析得到6個P值小于0.01的M/Z峰，從差異顯著蛋白質(zhì)峰的任意組合中，采用SVM篩選出預測值的youden指數(shù)最高的組合模型，得到5個標記蛋白，3個m/z位3400、3690、2902．6的標記物，在甲狀腺癌高表達，在甲狀腺良性結節(jié)低表達；而2個m/z位于3937、2687.8的標記物與之相反。聯(lián)合5個潛在標記物作為輸入值，用留-法分類器評價模型的預測效

14、果，在測試集上甲狀腺癌定性診斷模型的特異性87％，敏感性81％。 該模型進一步用14例血清標本盲法測試，8例甲狀腺癌中有7例，6例甲狀腺良性結節(jié)中有5例被正確預測，得出該模型的特異性為83％，敏感性為88％。 3．Ⅰ-Ⅱ期甲狀腺癌組和Ⅲ-Ⅳ期甲狀腺癌組的比較 Ⅰ-Ⅱ期甲狀腺癌組和Ⅲ-Ⅳ期甲狀腺癌組初步篩選出206個M/Z峰，利用判別分析處理數(shù)據(jù)，得到4個M/Z為2285、2182、2068、2196的標記物，均在

15、Ⅰ-Ⅱ期甲狀腺癌高表達，在Ⅲ-Ⅳ期甲狀腺癌低表達。以這4個M/Z為峰值的組合，交叉檢驗Ⅰ -Ⅱ期甲狀腺癌檢出的準確率77％，Ⅲ-Ⅳ期甲狀腺癌檢出的準確率86％，總的準確率為80％。 結論 不同的樣本需要不同的蛋白芯片，必須根據(jù)標本的特征選用。本試驗選用的WCX2蛋白芯片在可選用的數(shù)種芯片中所結合的蛋白量最多，根據(jù)其建立的實驗方法具有很好的重復性和穩(wěn)定性。在信息處理中，本試驗根據(jù)樣本量較小，而分布較整齊的特點，選用了在中小

16、樣本模型中推廣性、模型選擇、過擬和、緯數(shù)災難等問題得到很好解決的SW。 4．1運用SVM分析方法，聯(lián)合M/Z在6651、6452、6984的3個峰值在區(qū)分甲狀腺癌與正常人群對照判別模型中特異性86％，敏感性100％。對從健康人群中篩檢甲狀腺癌患者具有很好的應用價值。 4．2運用SVM分析方法，聯(lián)合M/Z在3400、3690、2902.6、3937、2687.8的5個峰值在區(qū)分甲狀腺癌與甲狀腺良性結節(jié)的判別模型中特異性為8

17、3％，敏感性為88％。對鑒別甲狀腺良惡性結節(jié)，甲狀腺癌術前定性判別具有很好的應用價值。 4．3運用判別分析方法，聯(lián)合M/Z在2285、2182、2068、2196的4個峰值對Ⅰ-Ⅱ期甲狀腺癌檢出的準確率77％，Ⅲ-Ⅳ期甲狀腺癌檢出的準確率86％。提示該判別模型可在術前判斷甲狀腺癌臨床分期，對術前分期的判斷有一定的應用價值。 4．4運用SELDI-TOF-MS技術結合生物信息學方法尋找甲狀腺癌篩查和定性診斷的血清蛋白標記物