基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組技術(shù)及其在大腸癌中的應(yīng)用研究.pdf

1、本文完善了甲基化同位素標(biāo)記定量技術(shù),并將其應(yīng)用在人類大腸癌早期診斷、淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究中,以解釋早期大腸癌、大腸癌轉(zhuǎn)移中的分子事件,篩選可以作為診斷標(biāo)準(zhǔn)的分子標(biāo)志物。
　　論文首次將甲基化同位素標(biāo)記定量引入凝膠電泳色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GeLC-MS)技術(shù)路線中,并標(biāo)準(zhǔn)化了甲基化標(biāo)記定量的實驗流程,開發(fā)相應(yīng)甲基化定量軟件,實現(xiàn)了高重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性的相對定量。另外,甲基化輔助的凝膠電泳色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),不僅僅可以定量

2、在兩樣品中蛋白質(zhì)表達的差異,也可以定量定性它們在降解水平的差異,這對于癌癥研究尤為重要。在早期大腸癌的研究中,相對于正常組織,我們發(fā)現(xiàn)了501個蛋白質(zhì)在早期大腸癌組織中表現(xiàn)出了兩倍以上差異表達(P<0.05)。在前80個差異表達蛋白質(zhì)中,20個存在降解水平的差異。通過生物信息學(xué)的功能分析,在泛素化.蛋白酶體通路中起著重要作用的兩個糖蛋白質(zhì)A1AT和CTSD被篩選出來進行后續(xù)驗證。血清學(xué)水平,組織芯片水平和基因水平的實驗驗證了A1Ar和C

3、TSD在早期大腸癌中的關(guān)鍵作用,并且通過聯(lián)用這兩個指標(biāo),96.77％的大腸癌病人可以特異性的被檢測出來。
　　基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組定量技術(shù)首次被應(yīng)用于大腸癌淋巴轉(zhuǎn)移研究中,并全面揭示了轉(zhuǎn)移潛力相關(guān)的蛋白質(zhì)水平上的表達差異。在此基礎(chǔ)上利用了生物信息學(xué)的手段對差異蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行判讀,獲得用以進一步功能分析的備選分子,并用定量PCR進行驗證。癌癥中蛋白質(zhì)翻譯后修飾的變化也是促進腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的重要分子事件,因此我們還對早期大腸癌和正常大

4、腸組織的蛋白質(zhì)糖基化和磷酸化后修飾進行了鑒定和比較分析,為大腸癌分子標(biāo)志物的臨床應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。
　　第一部分基于甲基化同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)組定量方法研究在基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域,同位素標(biāo)記色譜質(zhì)譜聯(lián)用相對其他技術(shù)有著高效、高精度和高序列覆蓋度的特點。但是昂貴的同位素標(biāo)記試劑以及復(fù)雜的同位素標(biāo)記方法限制了這些同位素標(biāo)記技術(shù)在蛋白質(zhì)定量領(lǐng)域的應(yīng)用。為了規(guī)避這些影響因素,我們引入了一個相對廉價的酯化反應(yīng),并對整個實驗流程進行優(yōu)

5、化使其適用于定量研究。我們將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的酶解肽段混合物分別進行甲基化和氘代甲基化標(biāo)記,按照不同比率混合之后送入色譜分離和質(zhì)譜鑒定,用以評價甲基化反應(yīng)在LC-LTQ-orbitrap路線中的表現(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)肽段的譜圖表明,甲基化反應(yīng)快速完全而且基本沒有副產(chǎn)物。觀測值和理論定量值在10倍差異之內(nèi)保持了優(yōu)良的線性。同一蛋白質(zhì)各個肽段的定量差異(標(biāo)準(zhǔn)偏差)小于10％,具有良好的重現(xiàn)性。另外在數(shù)據(jù)處理過程中,我們發(fā)現(xiàn)標(biāo)記位點大于6以及大于3電荷肽段的定

6、量結(jié)果與理論結(jié)果的差異相對較大。基于這些實驗現(xiàn)象,我們總結(jié)了一些規(guī)則以指導(dǎo)蛋白質(zhì)定量候選肽段的選擇,并將其寫入了編寫的軟件中。良好的線性和實驗重復(fù)性說明甲基化標(biāo)記能很好的勝任基于質(zhì)譜的定量研究。
　　第二部分蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究大腸癌早期診斷生物標(biāo)志物大腸癌是世界上致死幾率位列第二、中國位列第四的癌癥,隨著人民生活水平的提高,這個幾率還在不斷的上升。人的一生中患上大腸癌的幾率在6％左右,并且如果在早期發(fā)現(xiàn),90％的大腸癌病患可以手術(shù)

7、治愈。不幸的是,大腸癌被診斷出來的時候常常就已經(jīng)是晚期了。而且現(xiàn)在常用的一些生物標(biāo)志物例如癌胚抗原(CEA)缺乏必要的靈敏度和特異性。更可靠的生物標(biāo)志物以及新型診斷手段的發(fā)掘是大腸癌診療發(fā)展的必由之路。
　　鑒于大腸癌早診的嚴(yán)峻形勢,我們建立并標(biāo)準(zhǔn)化了一套甲基化同位素標(biāo)記色譜質(zhì)譜聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)方法,將其應(yīng)用于早期大腸癌和正常組織的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究。我們引入了經(jīng)典的甲基化反應(yīng),在這個反應(yīng)中乙酰氯催化dO或者d3甲醇和肽段的酸性基

8、團反應(yīng),生成具有3Da差異的成對標(biāo)記位點。我們使用了一維凝膠電泳分離(SDS-PAGE)后接一維色譜分離聯(lián)用LTQ-Orbitrap的技術(shù)用于提高蛋白質(zhì)的鑒定率。我們選擇了13例I期大腸癌,24例II期大腸癌以及相應(yīng)的『F常組織進行差異譜的驗證。在I期樣本中我們總共鑒定了1003個蛋白質(zhì),II期樣品中鑒定了1086個,其中837個蛋白質(zhì)被同時鑒定到。另外,相對于正常組織,501個蛋白質(zhì)在癌組織中表現(xiàn)出了差異表達的趨勢。與前人的研究一致,

9、這些蛋白質(zhì)中的三分之一是眾所周知的腫瘤相關(guān)因子。有趣的是,許多差異表達蛋白質(zhì)都是首次在大腸癌中被鑒定到,這或許得益于GeLC-MS路線對于蛋白質(zhì)鑒定的貢獻。和我們的預(yù)想一致,在GO功能分析中這些蛋白質(zhì)中很多都與調(diào)亡、鈣離子調(diào)節(jié)以及細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)。我們使用了iPA分析定量數(shù)據(jù)進行功能分析以構(gòu)建相互作用的網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)糖酵解/糖異生通路和泛素化通路是大腸癌中變化最大的兩條通路。另外,通過PROTOMAP分析,我們還發(fā)現(xiàn)了一些在后修飾和降解水平

10、上的有差異的蛋白質(zhì)。
　　為了規(guī)避單一方法帶來的假陰性和假陽性,我們選擇了在腫瘤發(fā)生發(fā)展中可能起到重要調(diào)控作用的差異表達蛋白質(zhì),進行進一步的免疫印跡以及組織芯片分析。首先,對于12個差異表達蛋白質(zhì)的組織免疫印跡實驗驗證了我們的GeLCMS實驗數(shù)據(jù)。其次,鑒于A1AT和CTSD兩個糖蛋白質(zhì)在泛素化蛋白酶體通路中的重要作用,我們用免疫印跡方法對14例早期大腸癌病人的腫瘤組織和正常大腸組織中的表達差異進行了評估。在大多數(shù)的腫瘤組織中A1

11、AT的表達降低,CTSD的表達升高,更有趣的是在A1AT的腫瘤組織免疫印跡圖中我們還觀察到了高分子量端的額外條帶,這極有可能是A1AT失活后形成的多聚體。我們還采用了372孔的組織芯片去檢測A1AT和CTSD這兩個蛋白質(zhì)的原位表達,發(fā)現(xiàn)這兩個蛋白質(zhì)分別具有了56.99％和83.97％的特異性。最后,為了能更方便的應(yīng)用于臨床診斷,我們采取了42例早期大腸癌病人的血清以及42例健康志愿者的血清進行免疫學(xué)分析。綜上,血清和組織水平的實驗都驗證

12、了我們前期的觀察,也進一步說明A1AT和CTSD可以作為可靠的大腸癌早期診斷生物標(biāo)志物候選分子用于臨床研究。
　　第三部分定量蛋白質(zhì)組方法篩選大腸癌淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)分子標(biāo)志物盡管惡性腫瘤治療已取得很大進展,但許多癌癥病人仍由于腫瘤的轉(zhuǎn)移而死亡。有鑒于此,腫瘤的侵潤和轉(zhuǎn)移成為了成功治療腫瘤的最大障礙。淋巴轉(zhuǎn)移是大腸癌轉(zhuǎn)移的主要途徑,目前還未見基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于大腸癌淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)分子標(biāo)志物篩選的報道。本論文采用甲基化同位素標(biāo)記輔助

13、兩維色譜質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)路線,分析淋巴轉(zhuǎn)移大腸癌和末轉(zhuǎn)移早期大腸癌組織樣品的蛋白質(zhì)水平表達差異。共鑒定到了651種非冗余的差異表達蛋白質(zhì),取0.95的差異表達置信度進行分析我們總共篩選出了65個蛋白質(zhì)作為候選的生物標(biāo)志物。因為癌細(xì)胞與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用是淋巴轉(zhuǎn)移的前提,通過GO功能分析,LGALS3BP,SAFB,CAVl,H1N1,S100A4.,EIF3F,ERH,TPMl這幾個與粘附、侵襲、運動相關(guān)的蛋白質(zhì)因子被挑選出來進行其

14、他水平的驗證。考慮到測試的假陽性,我們另取了16例淋巴轉(zhuǎn)移大腸癌和16例非淋巴轉(zhuǎn)移的大腸癌組織進行免疫印跡和基因水平的定量PCR實驗。在淋巴轉(zhuǎn)移前后的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)并驗證了與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)的差異表達蛋白質(zhì),印證了大腸癌淋巴轉(zhuǎn)移的分子機制。
　　第四部分高通量大腸癌蛋白質(zhì)組后修飾的研究本部分主要研究了早期大腸癌和正常大腸組織中的磷酸化和糖基化后修飾差異。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾如磷酸化、糖基化和泛素化等,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化

15、、細(xì)胞骨架調(diào)控、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)活動、肌肉收縮、新陳代謝,腫瘤發(fā)生等多種生命活動過程。當(dāng)細(xì)胞中的翻譯后修飾狀態(tài)發(fā)生變化時,可能引起一系列的疾病,因此鑒定后修飾的位點、定量不同生理病理狀態(tài)下的相對量的變化對于更好的理解生物體內(nèi)的疾病發(fā)生發(fā)展機制是十分必要的。定量蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)原則上都能適用于翻譯后修飾肽段的分析,但是翻譯后修飾的含量都比較低,需要經(jīng)過預(yù)富集才能方便的應(yīng)用與質(zhì)譜檢測。本部分的主要內(nèi)容是檢測大腸癌發(fā)生發(fā)展中磷酸化水平的變化,大

16、腸癌組織和正常組織的酶解肽段在經(jīng)過甲基化同位素標(biāo)記之后,采用固相金屬離子親和色譜(IMAC)和二氧化鈦填料富集磷酸化的肽段。甲基化標(biāo)記反應(yīng)封閉了肽段中原有的酸性位點從而能富集過程的效率,在前期的試驗中磷酸化富集的特異性達到了98.28％。另外我們還發(fā)現(xiàn),IMAC相對二氧化肽有著更好的富集特異性,而基于二氧化鈦的富集有更高的回收率。此外,新型的納米核殼材料被合成出來用于大腸癌組織樣品的糖基化后修飾富集,鑒定到了屬于155個糖蛋白質(zhì)的194

17、個糖肽。大腸癌中后修飾形式的改變可以作為大腸癌發(fā)生、發(fā)展以及療效評價的表征手段。
　　第五部分中國人健康肝臟蛋白質(zhì)表達譜的免疫學(xué)定量研究人肝蛋白質(zhì)組計劃是人類蛋白質(zhì)組組織(HUPO)發(fā)起的首個關(guān)于人類特定器官的蛋白質(zhì)組研究項目,旨在建立中國人健康肝臟的表達譜,獲得與人類肝臟蛋白質(zhì)表達、分類、功能網(wǎng)絡(luò)相關(guān)的最全面的信息。規(guī)?；咄康鞍踪|(zhì)組的定量分析一直是科技界的難題,人肝蛋白質(zhì)組計劃采用了優(yōu)化肽段計數(shù)的質(zhì)譜半定量方法,通過三種分離

18、鑒定技術(shù)路線,鑒定到了分布在6個濃度數(shù)量級上的6788個95％置信度的非冗余蛋白質(zhì)。為了驗證以上技術(shù)路線中質(zhì)譜定量的準(zhǔn)確性,我們在豐度從低到高的6個數(shù)量級上各選擇了一定數(shù)量的蛋白質(zhì)進行免疫分析。在抗原抗體選擇時我們首先將已有的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)列表和商用抗體列表進行比對,剔除極端分子量(>150kD和<30kD)的抗原,訂購成對的抗原抗體。在酶聯(lián)免疫分析(ELISA)和免疫印跡(WB)試驗中,抗原(標(biāo)準(zhǔn)蛋A質(zhì))和肝臟蛋白質(zhì)提取液各自取一個相應(yīng)

19、的濃度梯度上樣,并不斷的重復(fù)實驗直到所有肝臟蛋白質(zhì)樣品的灰度都落在標(biāo)準(zhǔn)蛋A質(zhì)的濃度梯度之間,與此同時通過作標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得肝臟中該蛋白質(zhì)的絕對含量。對于少數(shù)缺失免疫學(xué)數(shù)據(jù)的濃度數(shù)量級,采用標(biāo)準(zhǔn)加入法的色譜分析,用紫外吸收的強度來評估肝臟樣品中該蛋白質(zhì)的含量。除了2個偏差較大的數(shù)據(jù),免疫學(xué)方法得到的蛋白質(zhì)絕對含量在總體上驗證了肽段計數(shù)的質(zhì)譜半定量數(shù)據(jù),為中國人健康肝臟組織蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的建立提供了重要依據(jù)。
　　第六部分增加電荷數(shù)提高電子

20、轉(zhuǎn)移解離碎裂效率在定量蛋白質(zhì)組中的應(yīng)用研究用于肽段測序的串級質(zhì)譜是蛋白質(zhì)組大規(guī)模鑒定中的核心技術(shù)。碰撞誘導(dǎo)解離(CID)作為最常用的肽段碎裂質(zhì)譜技術(shù)主要適用于雙電荷的中短肽段分析,但是由于CID的能量較高,常常會在碰撞過程中丟失肽段后修飾的信息。相對于CID,2004年發(fā)展的新型電子轉(zhuǎn)移解離(ETD)技術(shù)更為溫和,適于分析多電荷的長肽段,并能夠保持肽段上的后修飾信息。受限制于能量傳遞的效率,ETD對雙電荷離子的碎裂效率和產(chǎn)生離子碎片的序

21、列覆蓋度較為有限。由于70％以上胰蛋白酶酶解肽段在電噴霧中都為2電荷,致使ETD在常規(guī)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析中碎裂效率不高。目前,研究者主要通過提高肽段的電荷數(shù)來增強ETD的碎裂效率。這些方法包括:1.提高鞘氣的溫度;2.增加色譜流動相的表面張力;3.采用AspN、LVsC等能產(chǎn)生大肽段的酶;4.對肽段進行化學(xué)修飾使其更適于帶上高電荷。為了對比這些方法在提高ETD鑒定效率方面的效能,我們分別采用了能產(chǎn)生大肽段的LvsC酶,對trypsi酶解肽