HHV-8ORF57啟動子中應答元件在RTA激活和IRF-7抑制基因表達中的作用.pdf

1、人類8型皰疹病毒(human herpesvirus8,HHV-8)也稱卡波西肉瘤相關皰疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV),是艾滋病患者最常見并發(fā)癥-卡波希肉瘤的致病原。與其它皰疹病毒類似,HHV-8感染也會經歷潛伏和裂解周期,潛伏向裂解復制的轉換由HHV-8開放閱讀框(open reading frame,ORF)50基因編碼的復制與轉錄激活蛋白(replication

2、and transcription activator,RTA)來控制。RTA可以通過與靶基因啟動子上的RTA應答原件(RTA responseelement,RRE)直接結合而激活下游病毒基因的轉錄,這些下游基因包括PAN、K2、K9、K14、ORF37、ORF52、ORF56和ORF57基因等。病毒的ORF57基因編碼一個稱為mRNA轉錄物積累蛋白的病毒早期核蛋白,是控制病毒復制從早期到晚期轉換的關鍵。ORF57啟動子中的40 bp

3、區(qū)段(nt81904-81943)介導RTA的轉錄激活。在此區(qū)段中已發(fā)現(xiàn)兩個富含AT的RTA應答元件,分別稱為RRE1和RRE2,其中RRE1與病毒K8啟動子序列同源,而RRE2不僅結合RTA,還能結合宿主編碼的干擾素調節(jié)因子7(interferon regulatory factor7,IRF-7)。RTA和IRF-7對RRE2的競爭影響RTA對ORF57啟動子的轉錄激活,并調控病毒的活化。在RRE1和RRE2之間有一個7 bp的重組

4、信號序列結合蛋白Jκ(recombination signal-bindingprotein Jκ RBP-Jκ)識別位點,可能參與RTA與RRE的結合。
　　 為研究HHV-8 ORF57啟動子40 bp區(qū)段中的各元件對RTA和IRF-7的應答,以及尋找該區(qū)段外新的IRRE,本文利用上游引物1-5和下游引物6或7擴增ORF57啟動子片段,分別插入到pGL3-basic載體來構建系列缺失型報告質粒S1-S5和L1-L5,它們分別

5、包含ORF57啟動子中從nt81556,81904,81918,81930或81944到轉錄起始位點1(nt82003)或轉錄起始位點2(nt82081)之間的序列。此外還對元件進行不同組合構建出報告質粒C1-C8,以檢測應答元件的數(shù)目和距離對RTA激活和IRF-7抑制的影響。以S1-s5報告質粒單獨轉染或與RTA和IRF-7表達質粒共轉染293T細胞,測定螢火蟲熒光素酶活性,發(fā)現(xiàn)RRE1對于RTA的轉錄激活非常關鍵,缺失RRE1的報告

6、質粒對RTA幾乎沒有應答。用同樣方法檢測L1-L5報告質粒,發(fā)現(xiàn)缺失RREl的報告質粒仍保留對RTA和IRF-7的應答,直至進一步缺失掉RBP-Jκ位點才徹底喪失對RTA和IRF-7的應答能力。比較S系列與L系列報告質粒的轉染結果發(fā)現(xiàn),在兩個轉錄起始位點之間,即nt82003和82081之間的78 bp區(qū)段中可能存在一個新的功能性RRE,它能介導RTA的轉錄激活,還能彌補由于缺失RRE1造成的對RTA應答的缺失。我們將這個新鑒定的功能性

7、RRE命名為RRE4,對其精確位置和作用機制還有待于進一步深入的研究。共轉染IRF-7表達質粒發(fā)現(xiàn),IRF-7除了能有效抑制RRE1介導的RTA激活外,還能抑制RRE4介導的RTA激活,暗示IRF-7對臨近RRE的抑制不表現(xiàn)出方向性。C1-C8報告質粒的轉染結果顯示,增加RRE1的數(shù)目對RTA的激活作用無顯著影響,但是增加RBP-Jκ位點的數(shù)目不僅使RTA的激活得到增強,且RTA的激活作用不能被IRF-7所抑制。反之,缺失RBP-Jκ位

8、點的報告質粒對RTA幾乎沒有應答,暗示RBP-Jκ位點在介導RTA激活ORF57啟動子方面的關鍵作用。通過改變應答元件之間的距離發(fā)現(xiàn),輕微加大RRE1與RBP-Jκ位點的距離并不影響RTA的轉錄激活和IRF-7的抑制作用,說明40 bp區(qū)段是可分的。但是,RBP-Jκ位點與RRE2之間的距離顯著影響RTA的轉錄激活,人為縮短或加大二者之間距離的報告質粒都不再具備對RTA的應答能力。本文的工作闡明了啟動子中應答元件的數(shù)目和距離對病毒基因表