HHV-8ORF57啟動(dòng)子中應(yīng)答元件在RTA激活和IRF-7抑制基因表達(dá)中的作用.pdf

1、人類8型皰疹病毒(human herpesvirus8,HHV-8)也稱卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV),是艾滋病患者最常見(jiàn)并發(fā)癥-卡波希肉瘤的致病原。與其它皰疹病毒類似,HHV-8感染也會(huì)經(jīng)歷潛伏和裂解周期,潛伏向裂解復(fù)制的轉(zhuǎn)換由HHV-8開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)50基因編碼的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄激活蛋白(replication

2、and transcription activator,RTA)來(lái)控制。RTA可以通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子上的RTA應(yīng)答原件(RTA responseelement,RRE)直接結(jié)合而激活下游病毒基因的轉(zhuǎn)錄,這些下游基因包括PAN、K2、K9、K14、ORF37、ORF52、ORF56和ORF57基因等。病毒的ORF57基因編碼一個(gè)稱為mRNA轉(zhuǎn)錄物積累蛋白的病毒早期核蛋白,是控制病毒復(fù)制從早期到晚期轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵。ORF57啟動(dòng)子中的40 bp

3、區(qū)段(nt81904-81943)介導(dǎo)RTA的轉(zhuǎn)錄激活。在此區(qū)段中已發(fā)現(xiàn)兩個(gè)富含AT的RTA應(yīng)答元件,分別稱為RRE1和RRE2,其中RRE1與病毒K8啟動(dòng)子序列同源,而RRE2不僅結(jié)合RTA,還能結(jié)合宿主編碼的干擾素調(diào)節(jié)因子7(interferon regulatory factor7,IRF-7)。RTA和IRF-7對(duì)RRE2的競(jìng)爭(zhēng)影響RTA對(duì)ORF57啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活,并調(diào)控病毒的活化。在RRE1和RRE2之間有一個(gè)7 bp的重組

4、信號(hào)序列結(jié)合蛋白Jκ(recombination signal-bindingprotein Jκ RBP-Jκ)識(shí)別位點(diǎn),可能參與RTA與RRE的結(jié)合。
　　 為研究HHV-8 ORF57啟動(dòng)子40 bp區(qū)段中的各元件對(duì)RTA和IRF-7的應(yīng)答,以及尋找該區(qū)段外新的IRRE,本文利用上游引物1-5和下游引物6或7擴(kuò)增ORF57啟動(dòng)子片段,分別插入到pGL3-basic載體來(lái)構(gòu)建系列缺失型報(bào)告質(zhì)粒S1-S5和L1-L5,它們分別

5、包含ORF57啟動(dòng)子中從nt81556,81904,81918,81930或81944到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)1(nt82003)或轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)2(nt82081)之間的序列。此外還對(duì)元件進(jìn)行不同組合構(gòu)建出報(bào)告質(zhì)粒C1-C8,以檢測(cè)應(yīng)答元件的數(shù)目和距離對(duì)RTA激活和IRF-7抑制的影響。以S1-s5報(bào)告質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染或與RTA和IRF-7表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,測(cè)定螢火蟲(chóng)熒光素酶活性,發(fā)現(xiàn)RRE1對(duì)于RTA的轉(zhuǎn)錄激活非常關(guān)鍵,缺失RRE1的報(bào)告

6、質(zhì)粒對(duì)RTA幾乎沒(méi)有應(yīng)答。用同樣方法檢測(cè)L1-L5報(bào)告質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)缺失RREl的報(bào)告質(zhì)粒仍保留對(duì)RTA和IRF-7的應(yīng)答,直至進(jìn)一步缺失掉RBP-Jκ位點(diǎn)才徹底喪失對(duì)RTA和IRF-7的應(yīng)答能力。比較S系列與L系列報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染結(jié)果發(fā)現(xiàn),在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間,即nt82003和82081之間的78 bp區(qū)段中可能存在一個(gè)新的功能性RRE,它能介導(dǎo)RTA的轉(zhuǎn)錄激活,還能彌補(bǔ)由于缺失RRE1造成的對(duì)RTA應(yīng)答的缺失。我們將這個(gè)新鑒定的功能性

7、RRE命名為RRE4,對(duì)其精確位置和作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入的研究。共轉(zhuǎn)染IRF-7表達(dá)質(zhì)粒發(fā)現(xiàn),IRF-7除了能有效抑制RRE1介導(dǎo)的RTA激活外,還能抑制RRE4介導(dǎo)的RTA激活,暗示IRF-7對(duì)臨近RRE的抑制不表現(xiàn)出方向性。C1-C8報(bào)告質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示,增加RRE1的數(shù)目對(duì)RTA的激活作用無(wú)顯著影響,但是增加RBP-Jκ位點(diǎn)的數(shù)目不僅使RTA的激活得到增強(qiáng),且RTA的激活作用不能被IRF-7所抑制。反之,缺失RBP-Jκ位

8、點(diǎn)的報(bào)告質(zhì)粒對(duì)RTA幾乎沒(méi)有應(yīng)答,暗示RBP-Jκ位點(diǎn)在介導(dǎo)RTA激活ORF57啟動(dòng)子方面的關(guān)鍵作用。通過(guò)改變應(yīng)答元件之間的距離發(fā)現(xiàn),輕微加大RRE1與RBP-Jκ位點(diǎn)的距離并不影響RTA的轉(zhuǎn)錄激活和IRF-7的抑制作用,說(shuō)明40 bp區(qū)段是可分的。但是,RBP-Jκ位點(diǎn)與RRE2之間的距離顯著影響RTA的轉(zhuǎn)錄激活,人為縮短或加大二者之間距離的報(bào)告質(zhì)粒都不再具備對(duì)RTA的應(yīng)答能力。本文的工作闡明了啟動(dòng)子中應(yīng)答元件的數(shù)目和距離對(duì)病毒基因表