BMP-2慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染后骨髓間充質(zhì)干細胞骨軟骨分化的研究.pdf

1、目的:
　　1.構(gòu)建骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）重組慢病毒表達載體；
　　2.TGF-β1、BMP-2重組慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs后向成骨、軟骨細胞的分化,為探索體外組織工程化骨軟骨的構(gòu)建提供新的思路。
　　方法:
　　1.構(gòu)建攜帶BMP-2基因的重組慢病毒表達載體：將提取的BMP-2 cDNA包裝至慢病毒表達載體，在脂質(zhì)體Lipofectamine2000作用下轉(zhuǎn)染293T細胞，通過酶切電泳分析和及DNA測序的

2、方法對重組DNA進行鑒定，RT-PCR測定病毒滴度；Western blot法檢測所構(gòu)建質(zhì)粒能在293T細胞中表達活性。
　　2.以BMP-2重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs，通過熒光表達法判定感染復數(shù)（Multiplicities of infection,MOI），免疫組化、Real-time PCR、Western blot和酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)判定感

3、染后的BMSCs中BMP-2的表達情況；MTT法檢測其轉(zhuǎn)染后的增殖活性；ALP活性檢測、堿性磷酸酶染色和茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成能力對其成骨分化能力進行分析；以TGF-β1重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs，經(jīng)一段時間的培養(yǎng)后，Ⅱ型膠原免疫組織化學染色及RT-PCR法檢測經(jīng)TGF-β1轉(zhuǎn)染后BMSCs的成軟骨分化能力。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建BMP-2重組慢病毒表達載體，經(jīng)酶切及測序結(jié)果完全正確，轉(zhuǎn)染293T細胞后獲得滴度

4、為4.07×108/ml慢病毒濃縮液。
　　2.BMP-2重組慢病毒可高效轉(zhuǎn)染BMSCs，最佳MOI值100，轉(zhuǎn)染后BMSCs可高效穩(wěn)定表達BMP-2 RAN及蛋白；MTT法檢測顯示轉(zhuǎn)染后BMSCs的生長增殖明顯增強；堿性磷酸酶染色、堿性磷酸酶活性檢測及鈣結(jié)節(jié)染色發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染兩周后堿性磷酸酶和鈣結(jié)節(jié)表達陽性；免疫組織化學染色及RT-PCR法發(fā)現(xiàn)TGF-β1轉(zhuǎn)染后的BMSCs可表達Ⅱ型膠原蛋白及Ⅱ型膠原RNA。
　　結(jié)論: