大鼠FasL基因重組慢病毒載體的構建及慢病毒顆粒包裝的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:構建用于真核細胞表達的重組慢病毒載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-FasL并包裝成慢病毒顆粒，為進一步研究轉FasL基因在同種異體器官移植中誘導免疫耐受，保護移植物的作用奠定基礎。 方法 1．根據(jù)PCA13-FasL和慢病毒表達載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP序列，按照引物設計原則，設計合成上下游引物，分別在其5’端引入EcoR Ⅰ和BamHⅠ酶切位點，以PCA13-FasL為模板行PC

2、R擴增目的基因。 2．FasL基因與慢病毒表達載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP經EcoRI和BamHI雙酶切，回收和純化。T<,4>DNA連接酶連接后轉化為感受態(tài)細胞DHSa，氨芐青霉素篩選。挑取單克隆菌落，作PCR鑒定及DNA序列測定，抽提陽性菌落pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-FasL質粒以病毒包裝。 3．脂質體法將重組慢病毒載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-FasL和包裝質粒

3、混合物(pPACK-GAG、pPACK-REV和pVSV)共轉染來源于人胚腎細胞系的293T細胞。收集轉染24h和48h的病毒上清液，再繼續(xù)感染H1299細胞，用于病毒滴度的測定。 結果 1．PCR擴增得到837bpDNA片段。 2．重組慢病毒載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-FasLcDNA序列測定結果與發(fā)表在GeneBank上的序列(U03470)完全一致。 3．通過感染H1299細胞，

4、測得的慢病毒滴度為10<'8>ifu/ml。足夠進一步試驗研究需要。 結論 1．成功克隆大鼠FasL基因片段。 2．成功構建攜帶大鼠FasL基因重組慢病毒載體pCDH1-MCS1-EF1-cogGFP-FasL。 3．重組慢病毒載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-FasL和包裝質粒混合物(pPACK-GAG、pPACK-REV和pVSV)成功包裝成高滴度慢病毒顆粒。為進一步研究轉基因在同種異體

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