大鼠FasL基因重組慢病毒載體的構(gòu)建及慢病毒顆粒包裝的研究.pdf

1、目的:構(gòu)建用于真核細(xì)胞表達(dá)的重組慢病毒載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-FasL并包裝成慢病毒顆粒，為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)FasL基因在同種異體器官移植中誘導(dǎo)免疫耐受，保護(hù)移植物的作用奠定基礎(chǔ)。 方法 1．根據(jù)PCA13-FasL和慢病毒表達(dá)載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP序列，按照引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)合成上下游引物，分別在其5’端引入EcoR Ⅰ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，以PCA13-FasL為模板行PC

2、R擴(kuò)增目的基因。 2．FasL基因與慢病毒表達(dá)載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切，回收和純化。T<,4>DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化為感受態(tài)細(xì)胞DHSa，氨芐青霉素篩選。挑取單克隆菌落，作PCR鑒定及DNA序列測(cè)定，抽提陽(yáng)性菌落pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-FasL質(zhì)粒以病毒包裝。 3．脂質(zhì)體法將重組慢病毒載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-FasL和包裝質(zhì)粒

3、混合物(pPACK-GAG、pPACK-REV和pVSV)共轉(zhuǎn)染來(lái)源于人胚腎細(xì)胞系的293T細(xì)胞。收集轉(zhuǎn)染24h和48h的病毒上清液，再繼續(xù)感染H1299細(xì)胞，用于病毒滴度的測(cè)定。 結(jié)果 1．PCR擴(kuò)增得到837bpDNA片段。 2．重組慢病毒載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-FasLcDNA序列測(cè)定結(jié)果與發(fā)表在GeneBank上的序列(U03470)完全一致。 3．通過(guò)感染H1299細(xì)胞，

4、測(cè)得的慢病毒滴度為10<'8>ifu/ml。足夠進(jìn)一步試驗(yàn)研究需要。 結(jié)論 1．成功克隆大鼠FasL基因片段。 2．成功構(gòu)建攜帶大鼠FasL基因重組慢病毒載體pCDH1-MCS1-EF1-cogGFP-FasL。 3．重組慢病毒載體pCDH1-MCS1-EF1-copGFP-FasL和包裝質(zhì)?；旌衔?pPACK-GAG、pPACK-REV和pVSV)成功包裝成高滴度慢病毒顆粒。為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)基因在同種異體