益生菌增加細(xì)胞表面半乳糖在抑制RV感染中的作用.pdf

1、真核細(xì)胞表面的糖蛋白或者糖脂中都含有半乳糖基化的糖鏈，研究表明半乳糖不僅廣泛地參與各種糖鏈的合成，作為終末殘基，半乳糖殘基影響細(xì)胞的識(shí)別、黏附、遷移和生長(zhǎng)。輪狀病毒(RV)在附著到腸上皮細(xì)胞的過(guò)程中需要識(shí)別細(xì)胞表面糖鏈，所以半乳糖與輪狀病毒感染細(xì)胞的過(guò)程緊密相關(guān)。
　　為闡明益生菌上清成分是否可通過(guò)誘導(dǎo)腸黏膜細(xì)胞表面半乳糖的增加而提高抗RV感染的效果。本研究通過(guò)3種不同的益生菌上清孵育豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)，誘導(dǎo)出3種不

2、同分化型IPEC-J2。以不同分化型IPEC-J2檢驗(yàn)益生菌在抗RV感染過(guò)程中的作用。同時(shí)，用D-半乳糖取代高糖DMEM培養(yǎng)基中的葡萄糖培養(yǎng)IPEC-J2細(xì)胞得到新的分化型，與益生菌誘導(dǎo)的分化型比較細(xì)胞表面半乳糖基化程度以及抗RV能力。
　　實(shí)驗(yàn)設(shè)干酪乳桿菌誘導(dǎo)組（g組）、枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)組（k組）、食淀粉乳桿菌誘導(dǎo)組(s組)、半乳糖誘導(dǎo)組（gal組）和未誘導(dǎo)細(xì)胞組。以上處理組又分為豬輪狀病毒(PRV)感染和未感染處理，采用凝集素

3、熒光技術(shù)觀測(cè)各處理組IPEC-J2細(xì)胞表面半乳糖的（半定）量的變化;利用Reed-Muench法檢測(cè)各感染細(xì)胞組輪狀病毒的滴度變化;用雙抗體夾心ELISA方法檢測(cè)感染12h、24h、48h、72h后各感染組細(xì)胞中輪狀病毒、β-半乳糖苷酶、β-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶含量，以各組未感染細(xì)胞作為對(duì)照。
　　由凝集素?zé)晒鈭D可知，以三株益生菌的上清或半乳糖孵育細(xì)胞，都能夠改變細(xì)胞表面半乳糖的含量。半數(shù)感染量檢測(cè)結(jié)果為當(dāng)輪狀病毒感72h時(shí)，未誘導(dǎo)細(xì)胞

4、組pRV感染后TCID50/0.1mL為10-7.15±0.14，g組pRV TCID50/0.1mL為10-3.875±0.125，食淀粉乳桿菌pRV TCID50/0.1mL為10-4.125±0.138，枯草芽孢桿菌pRV TCID50/0.1mL為10-4.16±0.144。病毒定量檢測(cè)結(jié)果顯示未誘導(dǎo)細(xì)胞組在感染的第12h到24 h RV含量變化不明顯，24h到48h病毒量持續(xù)上升，并且達(dá)到最大值，48h-72h病毒量有所下降。

5、而gal組在RV感染后24h內(nèi)，RV量低于其他組。提示半乳糖的抗病毒作用主要在病毒進(jìn)入復(fù)制期前最為明顯。三個(gè)益生菌上清組在RV感染的48h內(nèi)，RV量顯著低于未處理組，12h內(nèi)三個(gè)益生菌上清組組之間RV含量差異不顯著(P≥0.05)。
　　各組細(xì)胞的半乳糖苷酶含量檢測(cè)結(jié)果顯示:在未感染的各組細(xì)胞中，正常細(xì)胞組半乳糖苷酶的濃度高于g組、k組和s組(P＜0.05)。在RV感染的各組細(xì)胞中，在感染后第12h，s組和k組顯著低于正常細(xì)胞和g

6、組。在RV感染的第24h，正常細(xì)胞組和g組細(xì)胞酶濃度無(wú)差異（P≥0.05），s組和k組顯著低于正常細(xì)胞組和g組。在RV感染的第48h，正常細(xì)胞組和k組間酶濃度無(wú)差異(P≥0.05)，s組和g組的酶濃度顯著低于正常細(xì)胞和k組(P＜0.05)，s組和g組間無(wú)差異。在RV感染的第72h，s組和k組顯著低于正常細(xì)胞組和g組(P＜0.05)。各組細(xì)胞的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶含量檢測(cè)結(jié)果顯示:各組細(xì)胞在感染RV前，g組、k組和s組三個(gè)組的β-半乳糖苷酶濃度

7、低于正常細(xì)胞(P＜0.05);在RV感染后的第12h，g組細(xì)胞β-半乳糖苷酶濃度和正常細(xì)胞相比無(wú)差異(P＞0.05)，s組和k組則顯著低于正常細(xì)胞和g組(P＜0.05)，s組和k組間無(wú)差異(P＞0.05)。在RV感染的第24h，正常細(xì)胞和g組細(xì)胞β-半乳糖苷酶濃度無(wú)差異(P＞0.05)，s組和k組顯著低于正常細(xì)胞和g組(P＜0.05)，s組和k組間無(wú)差異(P＞0.05)。在RV感染的第48h，正常細(xì)胞和k組間β-半乳糖苷酶濃度無(wú)差異(P

8、＞0.05)，s組和g組的β-半乳糖苷酶濃度顯著低于正常細(xì)胞和k組(P＜0.05)，s組和g組間無(wú)差異(P＞0.05)。在RV感染的第72h，正常細(xì)胞和g組間β-半乳糖苷酶濃度無(wú)差異(P＞0.05)，s組和k組顯著低于正常細(xì)胞和g組(P＜0.05)，s組和k組間無(wú)差異(P＞0.05)。
　　綜上所述，干酪乳桿菌上清，食淀粉乳桿菌上清，枯草芽孢桿菌上清能夠提高IPEC-J2細(xì)胞表面的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶含量，增加細(xì)胞表面的半乳糖含量，從而