細(xì)胞表面α1,3半乳糖基化對肝癌細(xì)胞致瘤性的影響.pdf

1、目的：觀察人肝癌細(xì)胞表面1,3半乳糖基（1,3Gal）表位的表達(dá)對肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響以及進(jìn)一步探討利用鼠1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（α1,3galactosyltransferase，α1,3GT）進(jìn)行肝癌基因治療的可行性。
　　方法：1.構(gòu)建含有鼠α1,3GT全長cDNA基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-GT：采用RT-PCR方法從小鼠心臟組織中擴(kuò)增α1,3GT基因的全長cDNA，將其克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）內(nèi)

2、，從而構(gòu)建含有全長α1,3GT基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-GT，經(jīng)雙酶切鑒定后，對pcDNA-GT中的目的基因進(jìn)行測序。2.建立鼠α1,3GT穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞株Huh7-GT：①利用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將pcDNA-GT轉(zhuǎn)染到人肝癌細(xì)胞系Huh7中，經(jīng)G418抗性篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的陽性細(xì)胞克隆，命名為Huh7-GT，同時轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株Huh7-pcDNA作對照；②利用RT-PCR法檢

3、測α1,3GTmRNA在Huh7-GT中的表達(dá)；③然后利用直接免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)觀察α1,3-半乳糖基表位在Huh7-GT細(xì)胞表面的表達(dá)情況；④接著利用補體依賴的細(xì)胞殺傷試驗觀察人正常血清對Huh7-GT的殺傷效應(yīng)，以進(jìn)一步證實α1,3-半乳糖基表位在Huh7-GT細(xì)胞表面的表達(dá)。3.體外試驗觀察Huh7-GT致瘤性的變化：①利用MTT法檢測Huh7-GT細(xì)胞的生長速度；②利用平板克隆形成試驗檢測Huh7-GT細(xì)胞克隆形成能力的變化

4、；③流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測其細(xì)胞凋亡情況的變化。4.觀察Huh7-GT在裸鼠體內(nèi)的成瘤情況：取裸鼠12只，分為3組，平均每組4只，在每組裸鼠皮下分別注射Huh7-GT細(xì)胞，Huh7-pcDNA細(xì)胞和親本Huh7細(xì)胞，觀察這三組裸鼠的成瘤時間、瘤體大小和重量。
　　結(jié)果：1.從小鼠心臟組織中擴(kuò)增出一大小約1100bp的基因片段，經(jīng)酶切鑒定證實該基因片段成功地克隆到真核質(zhì)粒pcDNA3.1中，最后DNA測序證實該目的基因片度為全長108

5、0bp的鼠α1,3GT基因cDNA，遂將構(gòu)建的重組真核質(zhì)粒命名為pcDNA3.1GT。2.分別將pcDNA3.1-GT和pcDNA3.1空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，G418抗性篩選后分別獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株Huh7-GT和Huh7-pcDNA；經(jīng)RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)在Huh7-GT細(xì)胞中有α1,3GTmRNA的表達(dá)，而在Huh7-pcDNA和Huh7細(xì)胞中沒有檢測到α1,3GTmRNA的表達(dá)；直接免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)在Huh7-G

6、T細(xì)胞表面有α1,3-半乳糖基化表位的表達(dá)，Huh7-pcDNA和Huh7細(xì)胞表面沒有觀察到α1,3-半乳糖基化表位的表達(dá)；補體依賴的細(xì)胞殺傷試驗進(jìn)一步證實人正常血清對Huh7-GT有明顯的殺傷效應(yīng)。3.MTT法證實Huh7-GT細(xì)胞生長速度明顯減慢；平板克隆形成試驗發(fā)現(xiàn)Huh7-GT細(xì)胞單克隆形成能力減弱，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)Huh7-GT細(xì)胞凋亡增多；4.裸鼠成瘤試驗發(fā)現(xiàn)Huh7-GT細(xì)胞組裸鼠的成瘤時間與對照組相比延長，瘤體體積和重