調(diào)肝解毒方藥對(duì)癲癇大鼠認(rèn)知障礙的干預(yù)作用研究.pdf

1、隨著對(duì)癲癇認(rèn)識(shí)與研究的不斷深入，臨床發(fā)現(xiàn)很多癲癇患者除臨床發(fā)作癥狀外，還伴有學(xué)習(xí)記憶能力減退、情感行為異常、注意力分散及社會(huì)適應(yīng)能力下降等多種認(rèn)知功能受損的表現(xiàn)，影響患者身心健康與康復(fù)，但臨床缺乏針對(duì)性生的治療方藥，因此，進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究與藥物開發(fā)具有重要的臨床意義。中醫(yī)藥在控制癲癇發(fā)作、調(diào)節(jié)患者神經(jīng)功能、減少化學(xué)藥品的毒副作用以及改善學(xué)習(xí)記憶、調(diào)節(jié)焦慮等精神心理障礙等方面已取得可喜的成果，研究探討中醫(yī)藥改善癲癇這一特定狀態(tài)下，患者學(xué)

2、習(xí)記憶等認(rèn)知功能障礙，將具有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。印防己毒素(picrotoxin，PTX)化學(xué)點(diǎn)燃癲癇模型是一種與人類癲癇發(fā)生、形成具有高度相似性的慢性癲癇模型，該模型用于觀察癲癇學(xué)習(xí)記憶障礙基礎(chǔ)和藥物研究已有多家報(bào)道，我們以此模型為基礎(chǔ)，進(jìn)行相關(guān)的藥理學(xué)研究，試圖對(duì)臨床用藥起到指導(dǎo)作用。 我們認(rèn)為癲癇屬于“伏邪雜病”，以濁毒內(nèi)伏腦絡(luò)、腦神失養(yǎng)導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙、情感異常，應(yīng)用印防己毒點(diǎn)燃慢性癲癇大鼠模型，通過大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、病理組織

3、學(xué)、免疫組織化學(xué)、免疫印記吸附、逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)以及電鏡超微結(jié)構(gòu)等觀察方法，觀察調(diào)肝解毒方藥(天冰調(diào)督膠囊)對(duì)學(xué)習(xí)記憶、情感認(rèn)知行為、以及腦海馬等組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、乙酰膽堿脂酶(AchE)、神經(jīng)肽Y(NPY)、腺苷Al受體、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、N-甲基D-氨基天氡氨酸受體(NMDAR1)等表達(dá)影響，探討其可能的作用機(jī)制，為臨床治療提供依據(jù)。 本研究分六個(gè)部分，現(xiàn)將各部分研究

4、內(nèi)容概述如下。 一、調(diào)肝解毒方藥對(duì)點(diǎn)燃癲癇模型大鼠記憶情感行為改變的影響 目的：觀察調(diào)肝解毒方藥對(duì)印防己毒點(diǎn)燃癲癇模型大鼠情感行為、學(xué)習(xí)記憶改變的影響，探討其可能的作用機(jī)制。 方法：選用健康雄性Sprague-Dawley大鼠，100只，起始體重120±10g，隨機(jī)分組。正常組20只，腹腔注射等容積生理鹽水；PTX點(diǎn)燃組80只，按文獻(xiàn)方法，每天上午10：00至11：30腹腔注射PTX1.5mg/kg，連續(xù)注射20

5、～30天，達(dá)到完全點(diǎn)燃時(shí)停止造模。注射20天起錄像機(jī)觀察大鼠行為動(dòng)態(tài)變化。點(diǎn)燃行為依據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為五級(jí)，凡已獲得連續(xù)3次4級(jí)或4級(jí)以上完全發(fā)作者，被認(rèn)為完全點(diǎn)燃。隨機(jī)選取正常組和點(diǎn)燃模型大鼠進(jìn)行發(fā)作間期EEG描記，以確定模型點(diǎn)燃成功。隨機(jī)選取點(diǎn)燃成功大鼠72只，分為模型組、調(diào)肝低量組(TGDL組)、調(diào)肝高量組(TGGL組)、丙戊酸鈉組(VPA組)，每組18只。正常組大鼠18只同期觀察。調(diào)肝解毒方藥(天冰調(diào)督膠囊)主要成份為柴

6、胡、桂枝、天麻、全蝎、人工牛黃、黃連、絞股藍(lán)等，由制劑室提供濃縮浸膏。正常組、模型組灌服生理鹽水(10 ml/kg體重)；調(diào)肝低量組、調(diào)肝高量組分別以混懸液(1.2g/kg、4.8g/kg生藥量)灌胃；丙戊酸鈉組以(0.008g/kg)混懸液灌胃給藥。在造模第30天開始用藥觀察，觀察治療60天后檢測(cè)行為學(xué)指標(biāo)。以曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、抬高迷宮實(shí)驗(yàn)了解大鼠情感行為改變；交替電刺激Y型電迷宮實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)了解大鼠學(xué)習(xí)記憶改變情況。

7、 結(jié)論：成功復(fù)制出印防己毒點(diǎn)燃癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶與情感行為異常模型，該模型大鼠具有警覺水平降低、情感行為異常及學(xué)習(xí)記憶能力受損等認(rèn)知功能受損的表現(xiàn)，調(diào)肝解毒方藥可改善癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶與情感行為異常。 二、調(diào)肝解毒方藥對(duì)點(diǎn)燃癲癇模型大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、乙酰膽堿脂酶表達(dá)的影響 目的：觀察調(diào)肝解毒方藥對(duì)印防己毒點(diǎn)燃癲癇模型大鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、乙酰膽堿脂酶表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。 方法：印防己毒慢性癲癇大

8、鼠模型的制備及給藥方法同第一部分。在治療與行為學(xué)指標(biāo)測(cè)試后，正常組、丙戊酸納組各9只、模型組、調(diào)肝低量組、調(diào)肝高量組各8只大鼠，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)各組腦海馬組織BDNF、AchE、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)表達(dá)情況。各組大鼠深度麻醉，暴露心臟，自升主動(dòng)脈插管，生理鹽水沖洗；4％多聚甲醛磷酸緩沖液灌流固定，取嗅腦至中腦之間腦組織，相同灌流液固定，沉底。切取視交叉和乳頭體處垂直橫斷腦組織，做冠狀連續(xù)冰凍切片，切至海馬結(jié)構(gòu)，每片厚度為

9、40t姍。分為六套，進(jìn)行BDNF、AchE、ChAT等指標(biāo)免疫組織化學(xué)染色。統(tǒng)計(jì)各切片固定區(qū)域免疫陽性細(xì)胞數(shù)。 結(jié)論：點(diǎn)燃癲癇模型大鼠存在腦BDNF、AchE、ChAT表達(dá)異常，調(diào)肝解毒方藥可能通過調(diào)節(jié)腦BDNF表達(dá)或改善膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能起到改善學(xué)習(xí)記憶功能。 三、調(diào)肝解毒方藥對(duì)點(diǎn)燃癲癇模型大鼠神經(jīng)肽Y、腺苷Al受體表達(dá)的影響 目的：觀察調(diào)肝解毒方藥對(duì)印防己毒點(diǎn)燃癲癇模型大鼠神經(jīng)肽Y、腺苷Al受體表達(dá)的影響，探

10、討其可能的作用機(jī)制。 方法：模型制備及給藥方法同第一部分。在治療及行為學(xué)指標(biāo)測(cè)試后，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法(取材等方法同第二部分)和Western blot方法，檢測(cè)各組腦海馬等組織神經(jīng)肽Y、腺苷Al受體表達(dá)情況。Westem blot方法檢測(cè)，隨機(jī)選取每組6只大鼠，深度麻醉，取腦，液氮保存。冰盤取腦，超聲破碎，離心分裝，-20℃保存。測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行蛋白SDS電泳檢測(cè)，(考馬斯亮蘭染色比較上樣量)。PVDF膜處理。TBST沈膜

11、，分別加入一抗NPY、腺苷A1受體。洗膜及處理。DAB顯色。圖象分析系統(tǒng)檢測(cè)各組陽性條帶用Max OD值，統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)論：經(jīng)兩種檢測(cè)方法證實(shí)，點(diǎn)燃癲癇模型大鼠存在腦NPY、腺苷AlR表達(dá)的異常，調(diào)肝解毒方藥可能通過調(diào)節(jié)腦NPY、腺苷A1R表達(dá)起到改善學(xué)習(xí)記憶、情感行為異常的作用。 四、調(diào)肝解毒方藥對(duì)點(diǎn)燃癲癇模型大鼠海馬CREB，NMDAR1表達(dá)的影響 目的：觀察調(diào)肝解毒方藥對(duì)點(diǎn)燃癲癇模型大鼠海馬組織CREBmR

12、NA、NMDAR1 mRNA表達(dá)、磷酸化的pCREB、 NMDAR1表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制。 方法：各組以免疫組織化學(xué)方法測(cè)定腦組織pCREB、NMDAR1表達(dá)。以逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)大鼠海馬組織CREBmRNA、NMDAR1mRNA表達(dá)。以隨機(jī)選取經(jīng)治療后認(rèn)知行為檢測(cè)結(jié)束(每組6只)大鼠，深度麻醉，冰臺(tái)分離海馬，液氮保存。RNA提取及其檢測(cè)參照Trizol試劑說明書，依程序提取海馬總RNA，提取

13、RNA的完整性檢測(cè)。測(cè)量RNA純度和含量，選用OD<,250>/OD<,280>比值為1.8～2.0的RNA用作反轉(zhuǎn)錄。按照反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，合成擴(kuò)增NMDARl與CREB cDNA的引物序列，RT-PCR產(chǎn)物半定量，凝膠成像系統(tǒng)掃描并攝像，確定各組擴(kuò)增物相對(duì)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 結(jié)論：從不同層次與水平觀察到點(diǎn)燃癲癇模型大鼠存在海馬組織CREB與NMDAR1表達(dá)的異常，調(diào)肝解毒方藥可能通過調(diào)節(jié)CREB與NM

14、DAR1水平改善癲癇學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知障礙。 五、調(diào)肝解毒方藥對(duì)點(diǎn)燃癲癇模型大鼠海馬病理組織學(xué)與超微結(jié)構(gòu)改變的影響 目的：觀察調(diào)肝解毒方藥對(duì)點(diǎn)燃癲癇模型大鼠海馬病理組織學(xué)與超微結(jié)構(gòu)改變的影響，探討其可能的作用機(jī)理。 方法：模型制備及給藥方法同第一部分。腦組織灌注和取材、切片與第二部分免疫組織化學(xué)染色方法相同。尼氏染色以冷凍切片貼附于載玻片，梯度脫水，1％克紫染色，透明封片。用改良的Timm染色方法染色，各組檢測(cè)指標(biāo)依

15、據(jù)Gregory苔蘚纖維發(fā)芽(MFS)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。透射電鏡標(biāo)本制作和海馬超微結(jié)構(gòu)觀察，隨機(jī)選取大鼠(每組3只)深度麻醉，處死動(dòng)物，在斷血供后2分鐘之內(nèi)，將海馬組織切成1 nm<'3>的小塊，4％戊二醛固定，PBS充分清洗，1％鋨酸固定，PBS充分清洗，梯度脫水，包埋，聚合，切片厚度50nm，雙重電子染色，透射電鏡觀察、照相、分析結(jié)果。 結(jié)論：癲癇大鼠神經(jīng)元尼氏體脫失、苔蘚纖維發(fā)芽及海馬突觸可塑性改變可能是其學(xué)習(xí)記憶障礙的重要病理因

16、素。調(diào)肝解毒方藥可能通過改善模型大鼠神經(jīng)元功能、抑制苔蘚纖維發(fā)芽、改善海馬突觸活性，影響突觸可塑性，達(dá)到改善學(xué)習(xí)記憶目的。 六、毒邪可伏蘊(yùn)為癇，調(diào)肝解毒療癇呆--調(diào)肝解毒方藥治療癲癇認(rèn)知障礙的中醫(yī)理論探討 目的：依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，結(jié)合臨床和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，探討新學(xué)說與方法的可行性。 方法：溫習(xí)和回顧了中醫(yī)理論，從癲癇的病因、病機(jī)、治法、方藥治療等角度論證癲癇與“濁毒”伏邪的關(guān)系，進(jìn)而提出新的觀點(diǎn)與治療方法。 結(jié)