紅景天苷對Aβ1~40所致AD模型大鼠認知障礙的干預作用及其機制研究.pdf

1、阿爾茲海默病(Aizheimer's disease，AD)是一種以漸進性記憶減退、認知障礙及人格改變?yōu)橹饕R床特征的中樞神經系統(tǒng)退行性變性疾病。AD的病因復雜，至今尚未完全明了。人們提出了諸多假說，如淀粉級聯學說、tau蛋白異常修飾學說、膽堿能神經異常學說、代謝障礙學說、自由基與凋亡學說、興奮性氨基酸毒性學說和基因突變學說等，但均不能完全解釋AD的發(fā)病機理。隨著研究的不斷深入，人們逐漸意識到氧化應激、炎癥這些人體內廣泛存在的反應與AD

2、的發(fā)病有著密不可分的聯系。
　　大量研究證實，β淀粉樣蛋白(β-amyloid peptides，Aβ)在腦內的異常代謝和沉積是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。在Aβ刺激下小膠質細胞的活化、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotidephosphate，NADPH)氧化酶的激活、大量活性氧(reative oxygen species，ROS)的生成、有害自由基的產生、核因子-

3、κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的激活、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及誘導型一氧化氮合酶(induced nitric oxlde synthase，iNOS)等各種促炎因子的釋放，都直接或間接導致了神經系統(tǒng)的損傷。越來越多的研究發(fā)現，在Aβ引起的一系列神經毒性作用導致神經細胞功能紊亂和死亡，并引發(fā)癡呆的進程中，腦內慢性炎癥、氧化應激機制起著重要的作用?？寡住⒖寡趸?/p>

4、已成為防治AD的重要策略之一。
　　高原紅景天為景天科紅景天屬(Rhodiola)植物，為我國傳統(tǒng)的名貴藏藥材?，F代研究表明紅景天在抗氧化損傷、清除自由基和促進細胞代謝、增強細胞活力等方面有獨特功效。近年來，紅景天在增強腦功能、提高記憶力方面的作用逐漸受到重視。動物實驗亦表明，其在癡呆相關領域的治療上可能具有較好的應用前景。但紅景天苷作為紅景天的主要有效單體，其能否對抗Aβ產生的神經損傷，能否改善AD所致認知障礙以及通過何種具體機

5、制發(fā)揮作用迄今尚無系統(tǒng)深入的研究。
　　接受Aβ海馬內注射的大鼠，是較為成熟的AD模型，由于其較好地模擬了Aβ在腦內沉積的病理過程，較其他模型更為接近真實AD的進程。本研究通過建立Aβ誘導的AD動物模型，首次從行為學改變、代謝產物生成、酶學活性變化、蛋白表達激活、基因轉錄調控等多個層次上，較為系統(tǒng)地觀察了紅景天苷對Aβ1～40所致AD模型大鼠認知功能障礙的干預作用及其信號轉導機制。
　　1紅景天苷對Aβ1～40所致AD模型大

6、鼠認知障礙的干預作用
　　目的：建立Aβ1～40誘導的AD動物模型，觀察紅景天苷對Aβ1～40所致認知障礙的干預作用。
　　方法：Aβ1～40海馬內注射制備AD大鼠模型，術后用不同劑量紅景天苷(25 mg·kg-1、50 mg·kg-1、75 mg·kg-1)及石杉堿甲(0.05 mg·kg-1)分別灌胃治療，每日1次共21日。自第17日開始，經Morris水迷宮評測大鼠學習記憶能力，歷時5日。數據用x±s表示，用SPSS統(tǒng)

7、計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，組間資料應用重復測量的多因素方差分析，計數資料采用非參數的秩和檢驗，P<0.05為有顯著性差異。
　　結果：(1)定位航行實驗中，在測試的5日(d1～d5)內所有大鼠的逃避潛伏期都呈縮短趨勢。AD模型組較假手術組逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)。紅景天苷25 mg·kg-1組逃避潛伏期均值較模型組有所下降，但d1、d2及d5差異均未達統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)。紅景天苷50 mg·kg-1組及75 m

8、g·kg-1組逃避潛伏期各d均較模型組明顯縮短(P<0.05，P<0.01)。石杉堿甲組大鼠逃避潛伏期較模型組明顯縮短(P<0.01)，大致介于紅景天苷50 mg·kg-1組及75 mg·kg-1組之間。從d5的定位航行軌跡圖可看出：假手術組大鼠游泳路線清晰、目標明確，能在較短距離內找到平臺。給予Aβ海馬注射的大鼠尋找目標能力減弱，游泳路線繁亂、盲目、無序，需經較長距離才能找到平臺。而給予紅景天營及石杉堿甲治療的各組大鼠找到平臺前的游泳

9、距離縮短，尋找目標的能力得到改善，其中尤以紅景天苷50 mg·kg-1組、75 mg·kg-1組及石杉堿甲組改善較為顯著。(2)空間探索實驗中，與假手術組相比，AD模型組大鼠在原平臺所在象限搜索時間所占比值明顯降低(P<0.01)，搜索過程中跨過原平臺所在位置的次數也顯著減少(P<0.01)，紅景天苷25 mg·kg-1組大鼠在原平臺所在象限搜索時間所占比值及跨平臺次數均較模型組有所上升，但差異均未達統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)。紅景天

10、苷50 mg·kg-1組及、75 mg·kg-1組及石杉堿甲組大鼠在原平臺所在象限搜索時間所占比值及跨平臺次數均較模型組明顯升高和增加(P<0.01，P<0.01)，但未恢復至正常水平。
　　結論：接受Aβ1～40雙側海馬注射的大鼠，學習記憶能力明顯下降，給予紅景天苷治療的AD大鼠，學習記憶能力的下降受到阻止。說明成功建立了Aβ1～40雙側海馬注射誘導的AD大鼠模型。提示紅景天苷對Aβ1～40誘導AD大鼠認知功能障礙具有改善作用。

11、
　　2紅景天苷對Aβ1～40所致AD模型大鼠抗氧化能力的影響
　　目的：氧化應激是不同原因誘發(fā)神經損傷及各種中樞神經系統(tǒng)功能退行性紊亂的共同通路。Aβ能夠通過多種途徑激發(fā)腦內的氧化應激，產生大量的ROS。本實驗通過觀察紅景天苷對Aβ1～40所致AD模型大鼠海馬組織總ROS生成、血清及海馬SOD活性、血清及海馬MDA含量來探討紅景天苷對Aβ1～40所致AD模型大鼠腦內氧化應激損傷的影響。同時測定海馬AchE活性，對比紅景天苷

12、與石杉堿甲各自優(yōu)勢。
　　方法：Aβ1～40海馬內注射制備AD大鼠模型，術后給予紅景天苷(50mg·kg-1)及石杉堿甲(0.05 mg·kg-1)灌胃治療，每日1次共21日。建模成功后，利用DCFH-DA作熒光探針，流式細胞技術測定AD模型大鼠海馬組織總ROS生成，黃嘌呤氧化酶法測定大鼠血清及海馬SOD活性，硫代巴比妥酸法測定大鼠血清及海馬MDA含量，三硝基苯法測定大鼠海馬AchE活性。數據用x±s表示，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進

13、行統(tǒng)計學分析，用ANOVA及LSD進行組間比較及兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。
　　結果：(1)與假手術組相比，AD模型組大鼠海馬組織ROS含量明顯增加(P<0.01)。給予紅景天苷50 mg·kg-1·d-1治療21日后，AD大鼠海馬組織總ROS生成受到明顯抑制(P<0.01)，但未回到正常水平。給予石杉堿甲0.05 mg·kg-1·d-1治療21日后，大鼠海馬組織總ROS生成也受到明顯抑制，與AD模型組相比差異達顯著水

14、平(P<0.01)，但降低幅度不如紅景天苷組。(2)與假手術組相比，AD模型組大鼠血清及海馬SOD活性明顯降低(P<0.01)，給予紅景天苷50 mg·kg-1·d-1治療21日后，大鼠血清及海馬SOD活性較AD模型組明顯升高(P<0.01)，但未回到正常水平。給予石杉堿甲0.05 mg·kg-1·d-1治療21日后，大鼠血清SOD活性也較AD模型組明顯升高，差異達顯著水平(P<0.05)，但升高幅度不如紅景天苷組。(3)與假手術組相比

15、，AD模型組大鼠血清及海馬MDA含量明顯升高(P<0.01)，給予紅景天苷50 mg·kg-1·d-1治療21日后，大鼠血清及海馬MDA含量較AD模型組明顯降低(P<0.01)，但未回到正常水平。給予石杉堿甲0.05 mg·kg-1·d-1治療21日后，大鼠血清及海馬MDA含量也較AD模型組明顯降低，差異達顯著水平(P<0.05)，但降低幅度不如紅景天苷組。(4)與假手術組相比，AD模型組大鼠海馬AchE活性明顯升高(P<0.01)，給

16、予石杉堿甲0.05 mg·kg-1·d-1治療21日后，大鼠海馬組織AchE活性較AD模型組明顯降低(P<0.01)，但未回到正常水平。給予紅景天苷50 mg·kg-1·d-1治療21日后，大鼠海馬組織AchE活性也較AD模型組明顯降低(P<0.05)，但其降低幅度小于石杉堿甲組，只有石杉堿甲組的約50%。
　　結論：紅景天苷可能通過抑制Aβ1～40誘導的AD大鼠海馬組織總ROS生成、提高血清及海馬SOD活性、減少血清及海馬MDA

17、含量，從局部和整體提高了AD大鼠的抗氧化能力，減輕了神經組織氧化應激損傷。紅景天苷與石杉堿甲在抗氧化損傷及抑制AchE活性能力方面各自具有不同的機制和優(yōu)勢。
　　3紅景天苷對Aβ1～40所致AD模型大鼠海馬NADPH氧化酶-ROS通路的影響
　　目的：NADPH氧化酶是細胞內ROS的主要來源。本實驗通過觀察NADPH氧化酶的表達與激活，對紅景天苷抑制AD模型大鼠海馬組織ROS產生的上游機制進行探討。
　　方法：Aβ1～

18、40海馬內注射制備AD大鼠模型，術后給予紅景天苷(50mg·kg-1)灌胃治療，每日1次共21日。建模成功后，用Westernblot檢測大鼠海馬組織中gp91phox及p47phox蛋白表達，用RT-PCR技術檢測大鼠海馬gp91 phox及p47Pphox mRNA水平，用免疫沉淀結合Westernblot分析檢測大鼠海馬組織中P47phox蛋白磷酸化水平。數據用x±s表示，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，用ANOVA及LSD

19、進行組間比較及兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。
　　結果：(1)Western Bolt結果顯示，Aβ1～40可誘導AD模型大鼠海馬組織gp91phox及p47phox蛋白表達，使其明顯升高。AD模型組兩種蛋白的含量分別是假手術組的2.39倍及2.71倍(P<0.01)。而給予紅景天苷治療后，大鼠海馬組織gp91phox及p47Phox蛋白表達較AD模型組分別降低了32.6%及46.1%(P<0.01)。(2)RT-PCR結

20、果顯示，與假手術組相比，AD模型組大鼠海馬組織gp91phox及p47Phox mRNA表達明顯升高，分別為假手術組mRNA水平的1.99倍及2.12倍(P<0.01)。而給予紅景天苷治療，能夠明顯抑制Aβ1～40的這種誘導效應。紅景天苷組較AD模型組分別降低了36.5%及26.8%(P<0.01)。(3)IP-Western Bolt結果顯示，假手術組p47phox的磷酸化水平相對較低，給予Aβ1～40刺激的AD模型組p47phox磷

21、酸化水平較高，為假手術組的5.13倍，紅景天苷治療組p47phox的磷酸化水平明顯降低，較AD模型組下降了44.5%，但未回到正常水平。
　　結論：紅景天苷能夠抑制Aβ1～40誘導的AD海馬組織gp91Phox與p47PhoxmRNA轉錄、蛋白表達及亞基活化。說明紅景天苷抑制NADPH氧化酶產生ROS，可能是通過抑制其亞基表達和抑制其亞基激活，兩者協同作用的結果。紅景天苷通過對NADPH氧化酶-ROS通路的抑制，減輕了Aβ誘導的A

22、D腦內氧化應激反應。
　　4紅景天苷對Aβ1～40所致AD模型大鼠海馬ROS-NF-κB信號通路的影響
　　目的：ROS的生成不但能夠直接攻擊神經元細胞，造成神經損傷，還可作為細胞內重要的信使，介導與活化多種信號轉導通路，造成炎癥反應，間接導致神經組織和細胞的損傷。NF-κB可由ROS激活，并促進多種炎性因子的轉錄。由Aβ-ROS-NF-κB再到下游炎性基因這條信號通路，在AD的炎性進程中具有重要的意義。本實驗通過觀察紅景天

23、苷對Aβ1～40所致AD模型大鼠海馬ROS-NF-κB信號通路的影響，進一步揭示紅景天苷抑制腦內炎性損傷的機制。
　　方法：Aβ1～40海馬內注射制備AD大鼠模型，術后給予紅景天苷(50mg·kg-1)灌胃治療，每日1次共21日。建模成功后，用免疫組化及Westernblot檢測大鼠海馬組織中NF-κB、IκBα蛋白表達，用RT-PCR技術檢測大鼠海馬NF-κB及IκBα mRNA水平，用Westernblot分析磷酸化NF-κB

24、蛋白水平，用免疫沉淀結合Westernblot分析檢測大鼠海馬組織中IκBα蛋白磷酸化水平。數據用x±s表示，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，用ANOVA及LSD進行組間比較及兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。
　　結果：(1)免疫組化結果顯示：假手術組大鼠海馬組織內NF-κB染色陽性細胞少，著色淺。AD模型組海馬組織細胞內NF-κB染色陽性細胞數明顯增多，內含大量棕黃色陽性顆粒。紅景天苷組陽性細胞數較AD模型組明顯減少

25、，著色變淺。Western Bolt結果亦顯示，給予Aβ1～40海馬注射后，AD模型組大鼠海馬組織NF-κB蛋白表達較假手術組顯著升高，為假手術組的2.43倍(P<0.01)。給予紅景天苷治療后，大鼠海馬組織NF-κB蛋白表達較AD模型組降低了32.9%，差異顯著(P<0.01)。(2)RT-PCR結果顯示，與假手術組相比，AD模型組大鼠海馬組織NF-κB mRNA表達明顯升高，為假手術組的2.07倍(P<0.01)。給予紅景天苷治療后

26、，大鼠海馬組織NF-κB mRNA表達較AD模型組降低了35.9%(P<0.01)。(3)免疫組化對NF-κB蛋白的定位顯示：假手術組大鼠海馬組織僅有少數細胞胞漿內有NF-κB染色的棕黃色陽性顆粒，且著色淺，胞核內幾乎未見染色。AD模型組海馬細胞的胞漿與胞核中均可見大量棕黃色陽性顆粒分布，較假手術組明顯增多，紅景天苷組海馬細胞的胞核中NF-κB陽性顆粒較AD模型組明顯減少。IP-Western Bolt結果顯示：假手術組大鼠海馬組織中N

27、F-κB的磷酸化水平相對較低，給予Aβ1～40的模型組大鼠海馬組織中NF-κB磷酸化水平較高，為假手術組的4.91倍(P<0.01)，紅景天苷治療組大鼠海馬組織中NF-κB磷酸化水平明顯降低，較AD模型組下降了53.5%(P<0.01)，但未回到正常水平。(4)免疫組化結果顯示：AD模型組大鼠海馬組織細胞內IκBα陽性染色細胞數較假手術組明顯減少，而紅景天苷組IκBα陽性染色細胞數較AD模型組明顯增多。Western blot結果亦顯示

28、給予Aβ1～40海馬注射后，AD模型組大鼠海馬組織內IκBα水平較假手術組明顯下降，降幅達58.7%(P<0.01)，給予紅景天菅治療后，大鼠海馬組織IκBα水平明顯回升，較AD模型組上升了99.2%(P<0.01)。(5)RT-PCR結果顯示，與假手術組相比，AD模型組大鼠海馬組織IκBαmRNA表達明顯降低，降幅達62.7%(P<0.01)。給予紅景天苷治療后，大鼠海馬IκBα mRNA表達較AD模型組升高了92.2%(P<0.01

29、)。(6)IP-Western Bolt結果顯示，假手術組IκBα的磷酸化水平相對較低，給予Aβ1～40的模型組大鼠海馬組織中IκBα磷酸化水平較高，為假手術組的2.98倍，紅景天苷治療組大鼠海馬IκBα的磷酸化水平明顯降低，較AD模型組下降了33.4%。
　　結論：一方面紅景天苷通過抑制Aβ1～40誘導的NF-κB蛋白表達起到抑制ROS-NF-κB通路的作用，另一方面紅景天苷通過抑制IκBα的磷酸化降解、增強IκBα的表達，起到

30、抑制NF-κB激活進而抑制ROS-NF-κB通路的作用。這對于抑制Aβ介導的腦內炎癥反應具有重要的意義。
　　5紅景天苷對Aβ1～40所致AD模型大鼠海馬iNOS及RAGE表達的影響
　　目的：iNOS及RAGE受到NF-κB的誘導表達后，不但自身能直接介導Aβ誘導的多種神經毒性作用，還能反過來再次激活NF-κB，放大炎性效應，造成惡性循環(huán)。本實驗通過對iNOS及RAGE表達的觀察，進一步探討紅景天苷對Aβ1～40所致AD模

31、型大鼠腦內氧化應激及炎癥反應的綜合干預作用。
　　方法：Aβ1～40海馬內注射制備AD大鼠模型，術后給予紅景天苷(50mg·kg-1)灌胃治療，每日1次共21日。建模成功后，用免疫組化及Westernblot檢測大鼠海馬組織中iNOS及RAGE蛋白表達，用RT-PCR技術檢測大鼠海馬iNOS及RAGE mRNA水平。數據用x±s表示，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，用ANOVA及LSD進行組間比較及兩兩比較，P<0.05為有

32、顯著性差異。
　　結果：(1)免疫組化結果顯示：假手術組大鼠海馬組織內iNOS染色陽性細胞少，著色淺。AD模型組海馬組織細胞內iNOS染色陽性細胞數明顯增多，內含大量棕黃色陽性顆粒。紅景天苷組陽性細胞數較AD模型組明顯減少，著色變淺。(2)Western Bolt結果亦顯示，給予Aβ1～40海馬注射后，AD模型大鼠海馬組織iNOS蛋白表達較假手術組顯著升高，為假手術組的3.72倍。(P<0.01)。給予紅景天苷治療后，大鼠海馬組織

33、iNOS蛋白表達較模型組降低了47.4%(P<0.01)。(3)RT-PCR結果顯示，與假手術組相比，AD模型組大鼠海馬組織內iNOS mRNA表達明顯升高，為假手術組的2.08倍(P<0.01)。給予紅景天苷治療后，大鼠海馬組織iNOS mRNA表達較模型組降低了37.0%(P<0.01)。(4)免疫組化結果顯示：假手術組大鼠海馬組織細胞內，幾乎沒有RAGE染色的棕黃色陽性顆粒。AD模型組海馬細胞內RAGE染色陽性細胞數明顯增多，紅景

34、天苷組RAGE染色陽性細胞數較AD模型組明顯減少。(5)Western Bolt結果亦顯示，給予Aβ1～40海馬注射后，AD模型大鼠海馬組織RAGE蛋白表達較假手術組顯著升高，為假手術組的1.86倍。(P<0.01)。給予紅景天苷治療后，大鼠海馬組織RAGE蛋白表達較模型組降低了31.4%(P<0.01)。(6)RT-PCR結果顯示，與假手術組相比，AD模型組大鼠海馬組織RAGE mRNA表達明顯升高。為假手術組的1.65倍(P<0.0