順鉑誘導(dǎo)DNA損傷的核蛋白組學(xué)研究和microRNA分析.pdf

1、背景:應(yīng)用在卵巢癌、睪丸癌、膀胱癌、頭頸癌、官頸癌和肺癌等癌癥化療中的順鉑，是臨床上經(jīng)典的抗癌藥，存在已經(jīng)有30多年的歷史。順鉑主要的靶標(biāo)是DNA。順鉑進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)生水化，與DNA交聯(lián)，由于加合而變形的DNA結(jié)構(gòu)，不能進(jìn)行正常的復(fù)制，繼而觸發(fā)了死亡過(guò)程，這種DNA—Pt加合物被認(rèn)為是引起細(xì)胞毒性主要原因。
　　 由于順鉑雖然在癌癥治療中效果顯著，抗性問(wèn)題和副作用問(wèn)題，這也成為順鉑臨床治療的瓶頸。正是對(duì)順鉑藥物作用機(jī)理的研究深入，

2、才出現(xiàn)了后續(xù)二代鉑類藥Oxaliplatin，不會(huì)和順鉑產(chǎn)生交叉抗性，以及正在臨床三期實(shí)驗(yàn)的Satraplatin。說(shuō)明只有不斷地了解順鉑作用機(jī)理及抗性產(chǎn)生機(jī)制，才能為臨床藥物設(shè)計(jì)提供新的策略。目前對(duì)順鉑作用機(jī)制的研究已很多，但仍有許多問(wèn)題尚不明確。系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)作為高通量的分析方法，可以揭示一些未知或未預(yù)期的關(guān)聯(lián)。因此，本研究首先采用了蛋白組學(xué)方法分析細(xì)胞對(duì)順鉑的應(yīng)答反應(yīng)。
　　 考慮到順鉑主要靶標(biāo)是DNA，DNA損傷后的修復(fù)

3、也是發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，在本研究中，我們單獨(dú)提取了細(xì)胞的核蛋白，利用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D—PAGE)配合蛋白質(zhì)譜鑒定分析核內(nèi)蛋白組的變化。
　　 此外，MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，可調(diào)控60％哺乳動(dòng)物的mRNA，繼而調(diào)控蛋白的變化。有研究表明，P53不但調(diào)控一些miRNAs，也被某些miRNAs所調(diào)控。鑒于DNA損傷后P53和miRNAs的緊密聯(lián)系，我們推測(cè)m

4、iRNAs可能也參與順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)過(guò)程中。本研究的第二部分就是利用了另外一種高通量技術(shù)——microRNAs表達(dá)譜芯片，從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平以外的另一個(gè)層次——轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，探究了順鉑誘導(dǎo)DNA損傷中microRNAs可能發(fā)揮的作用。
　　 第一部分
　　 目的:利用雙向電泳技術(shù)研究順鉑處理HeLa細(xì)胞后，細(xì)胞核內(nèi)蛋白組發(fā)生的變化，借以挖掘在DNA損傷后細(xì)胞一系列應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮作用的蛋白。
　　 方法:

5、
　　 1．細(xì)胞存活率及DNA損傷的檢測(cè)，包括Trypan Blue，MTT和免疫熒光及熒光強(qiáng)度的軟件分析；
　　 2．細(xì)胞核蛋白的提取和超濾法純化和濃縮蛋白，蛋白BCA和Bradford法定量；
　　 3．雙向電泳聯(lián)合質(zhì)譜鑒定；
　　 4．Western Blot和熒光實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證雙向結(jié)果；RNAi技術(shù)進(jìn)行功能鑒定；流式細(xì)胞儀檢測(cè)RNAi后細(xì)胞凋亡和DNA損傷；
　　 結(jié)果:
　　

6、 1．隨著時(shí)間延長(zhǎng)和濃度的增大，順鉑的細(xì)胞毒性和作為DNA雙鏈斷裂標(biāo)志的γH2AX的形成具有明顯的時(shí)間效應(yīng)和濃度效應(yīng)；
　　 2．順鉑5μM處理HeLa細(xì)胞24 h后，細(xì)胞周期明顯停滯在S期，其比例從35％上升到86％，相應(yīng)地，G1期從54％下降到2％，G2期的比例沒(méi)有發(fā)生大的變化，僅從19％下降到12％；順鉑處理組的凋亡比例也從5．7％增加到17．5％；
　　 3．順鉑處理HeLa細(xì)胞后，在不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)雙向電泳圖譜比

7、較發(fā)現(xiàn)共有98個(gè)點(diǎn)發(fā)生改變。進(jìn)一步質(zhì)譜鑒定出28個(gè)核蛋白點(diǎn)；在這28個(gè)核蛋白中，有6個(gè)是不同處理組共有的，剩下的22個(gè)蛋白在順鉑處理后表達(dá)量上調(diào)的有12個(gè)，表達(dá)量下調(diào)的有10個(gè)；
　　 4．用定量PCR，Western blot和免疫熒光方法驗(yàn)證了雙向結(jié)果中Annexin Al，LaminB1和Hsp27蛋白表達(dá)的改變；
　　 5．對(duì)Annexin Al進(jìn)行了進(jìn)一步的功能鑒定，首先用免疫熒光的方法，直觀地觀察ANXAl干

8、擾后，對(duì)γH2AX焦點(diǎn)形成的影響。在5μM順鉑處理組中，與對(duì)照組相比，干擾組的γH2AX熒光的熒光強(qiáng)度明顯增加；用Western Blot和流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)ANXAl干擾后對(duì)細(xì)胞DNA損傷的影響，其結(jié)果和免疫熒光結(jié)果一致。
　　 6．在干擾Annexin Al表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)干擾組的自發(fā)凋亡比例(37．9％)已高于對(duì)照組(23．7％)。順鉑處理后，干擾組和對(duì)照組的凋亡比例沒(méi)有明顯差別，分別為54％和52％。
　　 結(jié)論:

9、r>　　 1．隨著時(shí)間延長(zhǎng)和濃度的增大，順鉑的細(xì)胞毒性和γH2AX的形成具有明顯的時(shí)間效應(yīng)和濃度效應(yīng)；
　　 2．質(zhì)譜鑒定出28個(gè)核蛋白點(diǎn)，主要參與miRNA生物合成，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，mRNA加工，轉(zhuǎn)運(yùn)，剪接，細(xì)胞周期和分裂，染色體分離，核纖層組成，細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，細(xì)胞凋亡等過(guò)程。
　　 3．Annexin Al干擾后，自發(fā)凋亡顯著上升，順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷加重。
　　 第二部分
　　 目的:研究順鉑處理誘導(dǎo)D

10、NA損傷的miRNA表達(dá)譜改變，從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯后水平以外的另一個(gè)層次——轉(zhuǎn)錄后調(diào)控系統(tǒng)，揭示順鉑可能的作用機(jī)制和細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)過(guò)程。
　　 方法:提取總RNA(包含microRNAs)；Bioanalyzer分析純度，Nanodrop測(cè)定濃度，芯片檢測(cè)，挑選一批miRNAs進(jìn)行Real time PCR驗(yàn)證；利用轉(zhuǎn)染，免疫熒光，流式細(xì)胞儀，Western blot明確篩選出的miR—191與DNA損傷的關(guān)系。
　　 結(jié)果

11、:
　　 1．芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在順鉑處理后有40個(gè)發(fā)生了顯著改變，并對(duì)其中13個(gè)miRNAs進(jìn)行了Real—time PCR驗(yàn)證。
　　 2．對(duì)鑒定出的miR—191進(jìn)行了深入研究。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miR—191mimic的HeLa細(xì)胞在順鉑處理12 h和24 h后細(xì)胞生存率較對(duì)照顯著下降；說(shuō)明miR—191使HeLa細(xì)胞對(duì)順鉑更敏感。
　　 3．在轉(zhuǎn)染了miR—191mimic的HeLa細(xì)胞中，已有部分細(xì)胞的細(xì)胞核被γH

12、2AX充滿，而對(duì)照組的γH2AX形成較少；經(jīng)過(guò)5μM順鉑處理24 h后，轉(zhuǎn)染了miR—191mimic組大部分細(xì)胞的細(xì)胞核充γH2AX，而此時(shí)的對(duì)照組，僅有少量的細(xì)胞核有γH2AX熒光分布。用軟件分析了γH2AX的平均熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，順鉑處理24 h后，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染了miR—191mimic組細(xì)胞γH2AX的平均熒光強(qiáng)度顯著增加。
　　 4．利用流式細(xì)胞儀和Western Blot進(jìn)一步確認(rèn)發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)