卡巴膽堿對脂多糖刺激大鼠腹腔巨噬細胞釋放炎癥細胞因子的影響及其受體研究.pdf

1、目的： 1.觀察卡巴膽堿對脂多糖刺激大鼠腹腔巨噬細胞釋放炎癥細胞因子的影響； 2．研究卡巴膽堿抑制脂多糖刺激大鼠腹腔巨噬細胞釋放促炎細胞因子的受體途徑，為卡巴膽堿用于膿毒癥和多器官功能障礙等過度炎癥性疾病的防治提供實驗依據(jù)。 方法：采用脂多糖(LPS，100ng/mL)刺激大鼠腹腔巨噬細胞模型，用酶聯(lián)免疫吸．附法(ELISA)和免疫熒光法進行研究。 1．卡巴膽堿對LPS刺激巨噬細胞釋放炎癥細胞因子的影響以

2、及和其他膽堿能受體激動劑作用的比較取雄性Wistar大鼠腹腔巨噬細胞，調(diào)整濃度為10<'6>細胞/mL，加入24孔細胞培養(yǎng)板中。分別加入卡巴膽堿(K1 2mmol/U、K2 0.2mmol/L、K3 0.02mmol/L、K4 2 μmol/L、K5 0.2 μmol/L、K6 0.02 μmol/L 6種濃度)、N樣膽堿能受體激動劑煙堿(nicotine)或M樣膽堿能受體激動劑毒蕈堿(muscarine)，室溫下處理15min；然后各

3、孔加入LPS，置于37℃、5％CO<,2>細胞培養(yǎng)箱中孵育4h。檢測細胞培養(yǎng)上清液中促炎細胞因子TNF-α、IL-6和抑炎細胞因子IL-10的濃度。實驗分為5組：①空白對照組C；②LPS對照組，L；③卡巴膽堿組，K；④煙堿組，N；⑤毒蕈堿組，M。其中K組用6種不同濃度卡巴膽堿(K1-K6)觀察其作用的差異并確定后續(xù)實驗中膽堿能受體激動劑的濃度。 2．卡巴膽堿抑制LPS刺激巨噬細胞釋放促炎細胞因子的受體途徑取上述濃度巨噬細胞置于2

4、4孔細胞培養(yǎng)板中，加入M樣膽堿能受體拮抗劑阿托品或N樣膽堿能受體α7亞基(α7nAChR)特異性拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素(α-Bgt)，室溫下孵育15min；后續(xù)實驗步驟同第一部分。檢測細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-6的濃度。實驗分為6組：①卡巴膽堿組，K；②煙堿組，N；③阿托品+卡巴膽堿組，AK；④阿托品+煙堿組，AN；⑤銀環(huán)蛇毒素+卡巴膽堿組，BK：⑥銀環(huán)蛇毒素+煙堿組，BN。免疫熒光法實驗取上述濃度細胞，在6孔培養(yǎng)板中制作細胞爬片

5、。先用卡巴膽堿或煙堿(5mmol/L)處理15min，再加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的α-Bgt(30 μg/mL)，4℃孵育15min。 沖洗、封片后，在熒光顯微鏡及激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察熒光強度并攝片。實驗分為4組：①陰性對照組；②陽性對照組：單純用FITC-α-Bgt標記細胞：③煙堿對照組：煙堿+FITC-α-Bgt；④卡巴膽堿組：卡巴膽堿+FITC-α-Bgt。 結論： 1、卡巴膽堿能顯著抑制L