食淀粉乳桿菌調(diào)節(jié)小鼠腸道GM3在抗RV感染中的作用.pdf

1、輪狀病毒(Rotavirus，RV)屬于呼腸孤病毒科，輪狀病毒屬，是引起幼畜病毒性腸炎、腹瀉的的主要病原之一，對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)危害巨大，神經(jīng)節(jié)苷酯GM3是其主要受體之一。
　　為了探討食淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus)在抗豬輪狀病毒(Procine Rotavirus，PRV)作用中GM3的調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究分別完成了食淀粉乳桿菌體外抗RV能力分析;食淀粉乳桿菌體內(nèi)對(duì)RV感染小鼠乳鼠的相關(guān)效應(yīng)和乳鼠空腸神經(jīng)

2、節(jié)苷脂GM3變化規(guī)律等兩方面研究，旨在闡明食淀粉乳桿菌抗RV部分機(jī)制。
　　本研究分為體外和動(dòng)物體內(nèi)兩個(gè)部分。體外實(shí)驗(yàn)以IPEC-J2細(xì)胞為細(xì)胞平臺(tái)、MTT法為檢驗(yàn)方法分析食淀粉乳桿菌體外抗RV能力;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)選擇中國(guó)昆明鼠乳鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，檢測(cè)食淀粉乳桿菌體內(nèi)對(duì)RV感染小鼠乳鼠的相關(guān)效應(yīng)，進(jìn)一步檢測(cè)了乳鼠空腸神經(jīng)節(jié)苷脂GM3變化規(guī)律和上述效應(yīng)相關(guān)性。
　　一、體外試驗(yàn)部分。主要包括食淀粉乳桿菌上清液抗RV能力穩(wěn)定性研究和益生

3、菌共培養(yǎng)上清液抗RV能力測(cè)定兩個(gè)方面:
　　1.食淀粉乳桿菌上清液抗RV能力穩(wěn)定性研究:連續(xù)將食淀粉乳桿菌傳代25次，每隔3代測(cè)定其上清抗RV能力，測(cè)定結(jié)果顯示:各代食淀粉乳桿菌對(duì)RV抑制率差異不顯著，表明該株食淀粉乳桿菌菌株抗RV能力較為穩(wěn)定，具有較為良好的傳代穩(wěn)定性。
　　2.益生菌共培養(yǎng)上清液抗RV能力測(cè)定:選取食淀粉乳桿菌和抗RV能力不等的4株屎腸球菌為實(shí)驗(yàn)材料，探究該株食淀粉乳桿菌與不同株屎腸球菌共培養(yǎng)后，共培養(yǎng)上

4、清液抗RV能力與單獨(dú)食淀粉上清液及單獨(dú)屎腸球菌上清液抗RV能力間的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:z4、z5和z8與食淀粉乳桿菌混合培養(yǎng)后上清液抗RV能力，介于單獨(dú)食淀粉乳桿菌和單獨(dú)z4、z5和z8上清液抗RV能力之間，差異不顯著(p＞0.05)。z7和食淀粉乳桿菌共培養(yǎng)上清液對(duì)RV抑制率均低于單獨(dú)屎腸球菌上清及單獨(dú)食淀粉乳桿菌上清。說(shuō)明該株食淀粉乳桿菌有良好的共培養(yǎng)穩(wěn)定性。
　　二、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分。主要包括食淀粉乳桿菌體內(nèi)對(duì)RV感染小鼠乳鼠的

5、相關(guān)效應(yīng)和食淀粉乳桿菌對(duì)乳鼠空腸神經(jīng)節(jié)苷脂GM3作用兩方面。試驗(yàn)乳鼠分為4組:正常組、病毒組、先灌胃益生菌后攻毒組-食淀粉組(Gavaged probiotic before inoculation group，BI group)和先攻毒后灌胃益生菌組-治療組(Gavaged probiotic after inoculation group，AI group)，26只每組，共飼喂11天(d)，從1d開(kāi)始BI組每只每天灌胃50μL益生菌

6、活菌液(106cfu/mL)，其他組每只每天飼喂等量PBS，病毒組、BI組和AI組4d時(shí)每只小鼠飼喂毒力為10-6.28TCID50/mL輪狀病毒50μL，AI組在4d時(shí)每天灌胃50μL益生菌活菌液(106cfu/mL)。
　　1.食淀粉乳桿菌體內(nèi)對(duì)RV感染小鼠乳鼠的相關(guān)效應(yīng):感染RV乳鼠的體重增長(zhǎng)率升降、糞樣病毒量多少和空腸黏膜組織學(xué)變化。
　　(1)體重增長(zhǎng)率測(cè)定結(jié)果顯示:飼喂1 d～4d時(shí)各組體重增長(zhǎng)率差異不顯著(p＞

7、0.05);飼喂4d～11d時(shí)正常組體重增長(zhǎng)率顯著高于其他組別(p＜0.05);攻毒前后飼喂食淀粉乳桿菌，乳鼠體重增長(zhǎng)率仍會(huì)出現(xiàn)一定程度的降低;BI組及AI組體重增長(zhǎng)率顯著高于病毒組(p＜0.05)，BI組和AI組體重增長(zhǎng)率差異不顯著(p＞0.05)。
　　(2)糞樣病毒量測(cè)定結(jié)果顯示:感染后2d、3d、4d、5d及7d時(shí)BI組RV含量均顯著低于病毒組(p＜0.05);AI組在感染后4d時(shí)RV含量顯著低于病毒組(p＜0.05)，其

8、他時(shí)間點(diǎn)差異不顯著。
　　(3)空腸黏膜組織學(xué)變化結(jié)果顯示:病毒組小腸上皮細(xì)胞出現(xiàn)輕微空泡變性，小腸絨毛內(nèi)部組織缺失較為嚴(yán)重，絨毛上皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生顯著變化，BI組及AI相對(duì)于病毒組，相關(guān)癥狀明顯減輕;BI組空腸絨毛長(zhǎng)度在攻毒后1d和3d時(shí)顯著高于病毒組(p＜0.05)，和正常組差異不顯著(p＞0.05); AI組空腸絨毛長(zhǎng)度大于病毒組，但差異不顯著(p＞0.05);攻毒后5d、7d時(shí)各組絨毛長(zhǎng)度差異不顯著(p＞0.05)。

9、　　2.食淀粉乳桿菌對(duì)乳鼠空腸神經(jīng)節(jié)苷脂GM3影響實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)方面:乳鼠空腸組織GM3定量ELISA檢測(cè)和乳鼠空腸組織GM3合成酶mRNA檢測(cè)。
　　(1)乳鼠空腸組織GM3定量ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，攻毒前:2d～4d時(shí)BI組及正常組差異不顯著(P＞0.05)，攻毒后:5d、9d及11d時(shí)BI組神經(jīng)節(jié)苷酯GM3含量顯著高于正常組及病毒組(P＜0.05);9d時(shí)病毒組神經(jīng)節(jié)苷酯GM3含量顯著高于正常組(P＜0.05); AI在5d

10、和11d時(shí)顯著高于病毒組(p＜0.05)，AI組在9d和11d時(shí)顯著低于BI組。
　　(2)乳鼠空腸組織GM3合成酶MusSt3gal5 mRNA結(jié)果顯示:攻毒前，BI組與正常組在2d、3d、4d時(shí)均差異不顯著(p＞0.05)，攻毒后，5d、9d時(shí)病毒組水平顯著低于正常組(p＜0.05);7d、9d及11d時(shí)BI組水平顯著低于病毒組(p＜0.05);5d、7d時(shí)AI組水平略低于病毒組(p＞0.05)。
　　(3)乳鼠空腸組織

11、GM3合成酶MusUGCG mRNA結(jié)果顯示:攻毒前，3d時(shí)BI組與正常組差異不顯著(p＞0.05)，攻毒后:7d、9d時(shí)病毒組水平均顯著低于正常組(p＜0.05);7d、9d、10d時(shí)BI組水平顯著低于正常組及病毒組(p＜0.05)，11d時(shí)AI組水平顯著低于病毒組(p＜0.05)。
　　綜上所述連續(xù)25代培養(yǎng)以及與4株屎腸球菌共培養(yǎng)后，該株食淀粉乳桿菌其抗RV能力仍然保持相對(duì)的穩(wěn)定性。該株食淀粉乳桿菌接種RV感染前后的乳鼠，其