HIFU治療后外周血CTL對(duì)同種腫瘤免疫治療作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的 前期工作發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度聚焦超聲(Highintensityfocusedultrasound，HIFU)治療后荷瘤鼠外周血淋巴細(xì)胞具有特異的抗腫瘤效應(yīng)。本研究擬觀察HIFU活化的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CytotoxicTlymphocyte，CTL)過繼免疫治療后，荷瘤鼠外周細(xì)胞免疫功能的變化和局部腫瘤細(xì)胞的凋亡與免疫效應(yīng)分子表達(dá)的關(guān)系，為闡明HIFU治療后活化的CTL免疫治療同種腫瘤的機(jī)制提供依據(jù)。 方法 1、HI

2、FU活化的CTL過繼免疫治療后荷瘤鼠細(xì)胞免疫功能的變化 90只正常C57BL／6J系小鼠，隨機(jī)分為三組：HIFU治療組(n=30)、HIFU假照組(n=30)和正常對(duì)照組(n=30)。前兩組小鼠背部接種H22肝癌細(xì)胞株，成瘤后(接種7d時(shí))分別接受HIFU治療或HIFU假照，對(duì)照組為正常小鼠，不接種腫瘤也不接受HIFU輻照。HIFU治療后第14天取三組小鼠外周血，應(yīng)用“淋巴細(xì)胞液分層法"和“免疫磁珠分離法"分離和純化CTL。

3、 30只正常C57BL／6J小鼠，隨機(jī)分為HIFU組(n--10)、假照組(n=10)和對(duì)照組(n=10)。三組小鼠背部分別皮下接種H22肝癌細(xì)胞株，于接種后第3天，分別接受尾靜脈注射HIFU治療組，HIFU假照組和正常對(duì)照組外周血CTL細(xì)胞l×106／次，每天一次，連續(xù)2d。流式細(xì)胞術(shù)測定治療2wk后各組小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化；MTT法檢測各組脾淋巴細(xì)胞對(duì)H22腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)；ELISA法檢測脾淋巴細(xì)胞與H22細(xì)

4、胞共培養(yǎng)24hr后上清液TNF-(~、IFN-~水平。 2．HIFU治療后外周血CTL對(duì)同種荷瘤鼠治療作用的機(jī)制 上述三組小鼠接受CTL過繼免疫治療后2wk，手術(shù)取出各組小鼠接種部位腫瘤組織塊，Hank's液漂洗后剪成小碎塊，并碾磨過鋼目篩制成單細(xì)胞懸液。采用DNA末端標(biāo)記法(TUNEL法)，通過流式細(xì)胞術(shù)測定各組小鼠腫瘤細(xì)胞的凋亡率；流式細(xì)胞術(shù)分別測定腫瘤組織內(nèi)淋巴細(xì)胞FasL和穿孔素表達(dá)情況，并對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)、

5、相關(guān)和多元線性回歸分析。 結(jié)果 1、HIFU活化的CTL過繼免疫治療后荷瘤鼠細(xì)胞免疫功能的變化 CTL過繼治療荷瘤鼠14d后，HIFU組、假照組和對(duì)照組小鼠外周血CD3+分別為55．73±6．11％、50．40±5．55％、50．61±6．66％，CD4+分別為25．22±4．19％、19．91±3．71％、19．01±2．62％，CD8+分別為16．48±2．59％、22．35±6．93％、21．82±5．82

6、％，CD49+/CD8+的比值分別為1．45±0．33、0．98±0．36、0．99±0．24；與假照組或?qū)φ战M比較，HIFU組外周血CD4+、CD4+／CD8+比值明顯增加，CD8+明顯下降，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HIFU組、假照組和對(duì)照組小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)H22腫瘤細(xì)胞的殺傷率(％)分別為29．33±5．30、8．45±2．16、9．32±1．45；與假照組和對(duì)照組比較，HIFU組脾淋巴細(xì)胞對(duì)H22細(xì)胞的細(xì)胞毒活性明顯增加，差異有顯

7、著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．001)。HIFU組、假照組和對(duì)照組小鼠脾淋巴細(xì)胞與H22腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)24hr后上清液TNF-(I和INF-~濃度(pg/m1)分別為497．30±55．81和956．26±81．33、299．37±33．79和492．85±49．06、274．81±27．12和475．13±44．54；與假照組和對(duì)照組比較，HIFU組TNF-α和INF-γ濃度明顯升高，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

8、HIFU治療后外周血CTL對(duì)同種荷瘤鼠治療作用的機(jī)制 CTL治療荷瘤鼠2wk后，HIFU組、假照組和對(duì)照組小鼠局部腫瘤細(xì)胞凋亡率(％)分別為16．50±7．42、1．68±1．33和1．62±1．45：三組小鼠局部腫瘤組織內(nèi)淋巴細(xì)胞FasL和穿孔素的表達(dá)率(％)分別為4．0l±1．36和14．43±4．84、1．03±0．30和3．11±1．57、0．97±0．35和3．07±1．07。HIFU組腫瘤細(xì)胞凋亡與FasL和穿孔素陽

9、性細(xì)胞數(shù)的相關(guān)系數(shù)(r)分別為0．9145和0．9619，呈密切正相關(guān)性(P