mIL-21瘤苗在腫瘤過繼免疫治療中作用的研究.pdf

1、過繼免疫治療可將大量體外擴增、活化的腫瘤抗原特異性免疫效應(yīng)細胞迅速傳遞給患者,釋放調(diào)控宿主免疫反應(yīng)的細胞因子和補充內(nèi)源性免疫效應(yīng)細胞,增強患者的細胞免疫功能,又可選擇性地抑制、殺傷腫瘤細胞,是目前治療惡性腫瘤的一個重要有效的輔助治療方法。但同時也面臨多種因素影響該策略的治療效果,包括：如何在體外獲得足夠數(shù)量的具有腫瘤殺傷效應(yīng)的特異性免疫活性細胞,如何促進輸注細胞在體內(nèi)存活、增殖并增強其腫瘤特異性的殺傷活性。 本實驗室成功構(gòu)建的m

2、IL-21-Sp2/0瘤苗細胞,可穩(wěn)定表達mIL-21。且前期的實驗結(jié)果也表明了其可在小鼠體內(nèi)誘導小鼠產(chǎn)生有效的抗腫瘤作用。隨著近期IL-21研究的不斷深入,其具有的多重的免疫調(diào)節(jié)功能也越發(fā)引起廣泛關(guān)注。尤其是在促進CD8+T細胞活化增殖,增強CTL細胞的活性及減少抗原特異性淋巴細胞凋亡中的所起的作用。 鑒于上述理論和實驗基礎(chǔ),本研究充分利用mIL-21-Sp2/0瘤苗的優(yōu)勢,首先以mIL-21-Sp2/0瘤苗細胞代替腫瘤細胞作

3、為刺激抗原,進行腫瘤特異性CTL的體外培養(yǎng),以改善原有混合淋巴細胞和腫瘤細胞培養(yǎng)(mixed lymphocyte tumor cell culture,MLTC)方法中的腫瘤細胞普遍存在免疫原性或抗原遞呈能力弱的缺點,為體外誘導特異性效應(yīng)細胞的增殖提供了新的思路。 其次利用穩(wěn)態(tài)驅(qū)動增殖的理論,通過大劑量的環(huán)磷酰胺誘導宿主鼠的淋巴細胞急劇減少,借以改善腫瘤細胞誘導的免疫耐受和抑制的微環(huán)境,使得輸注的效應(yīng)細胞可以更好地在宿主體內(nèi)增

4、殖、存活。并且根據(jù)在自穩(wěn)增殖早期接觸抗原利于效應(yīng)細胞形成與維持長期特異性免疫記憶能力的觀點,在過繼腫瘤特異性淋巴細胞的同時再給予mIL-21瘤苗免疫,以期提高過繼免疫治療的抗腫瘤效果。并通過對過繼細胞在小鼠體內(nèi)分裂增殖情況、殺傷功能的檢測和亞群表型變化的分析,對其機制進行了探討。 第一部分mIL-21瘤苗免疫致敏的同系鼠淋巴細胞過繼荷瘤鼠的抗腫瘤效應(yīng) 目的：篩選表達mIL-21的單克隆瘤苗細胞株,觀察使用mIL-21瘤苗

5、免疫小鼠的脾及淋巴結(jié)淋巴細胞過繼荷瘤鼠的抗腫瘤效果。 方法：采用G-418加壓、有限稀釋法獲取表達mIL-21細胞株并經(jīng)RT-PCR鑒定。篩選出的瘤苗細胞接種小鼠,一周后取小鼠脾及淋巴結(jié)的淋巴細胞,尾靜脈過繼同系Sp2/0細胞致瘤的荷瘤鼠,觀察腫瘤的生長情況及小鼠存活期。結(jié)果：篩選的mIL-21瘤苗細胞的RT-PCR檢測結(jié)果表明有mIL-21基因表達,其免疫小鼠的淋巴細胞過繼給同系荷瘤宿主,可見一定的抗腫瘤活性,腫瘤生長及存活期

6、等觀察指標優(yōu)于其它對照組。 結(jié)論:mIL-21-Sp2/0瘤苗細胞免疫小鼠的淋巴細胞過繼至荷瘤宿主體內(nèi)可產(chǎn)生一定的抗腫瘤免疫應(yīng)答,可用作過繼免疫治療的效應(yīng)細胞。 第二部分:mIL-21瘤苗細胞體外對鼠腫瘤特異性淋巴細胞增殖及功能的影響 目的：研究表達mIL-21的Sp2/0細胞與以滅活Sp2/0細胞預(yù)先免疫小鼠的淋巴細胞體外共培養(yǎng),是否對預(yù)致敏淋巴細胞增殖及功能有影響。 方法：獲取滅活Sp2/0細胞免疫小

7、鼠的淋巴細胞,在mIL-2存在的條件下,以mIL-21轉(zhuǎn)染的Sp2/0細胞為刺激細胞,用流式細胞術(shù)(FCM),檢測CFSE標記的淋巴細胞增殖和7-AAD標記的細胞毒活性；用ELISpot法確定分泌IFN-γ的淋巴細胞數(shù)量。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染mIL-21的Sp2/0細胞對預(yù)致敏的淋巴細胞增殖有明顯影響,活化的淋巴細胞對靶細胞的殺傷率與對照組相比有顯著增加,達35.57±4.72％(p<0.05),且分泌IFN-γ的細胞數(shù)量明顯增加?；罨?/p>

8、增殖后的淋巴細胞回輸至環(huán)磷酰胺預(yù)處理的小鼠,能產(chǎn)生針對該腫瘤細胞良好的保護作用,延長小鼠的成瘤時間。 結(jié)論：表達mIL-21的Sp2/0細胞在體外可有效促進腫瘤抗原特異性淋巴細胞活化及增殖,并增強其對腫瘤細胞的殺傷功能。 第三部分：過繼腫瘤特異性淋巴細胞聯(lián)合mIL-21瘤苗免疫抗腫瘤效應(yīng)的研究 目的：探討環(huán)磷酰胺(Cy)誘導小鼠淋巴細胞減少的狀態(tài)下,過繼mIL-21轉(zhuǎn)染的瘤苗細胞(mIL-21-Sp2/0)免疫致

9、敏的同系小鼠腫瘤抗原特異性淋巴細胞,并聯(lián)合mIL-21-Sp2/0瘤苗免疫抗腫瘤效應(yīng)的機制。 方法：Cy處理BALB/c小鼠,末次注射兩天后,以滅活mIL-21瘤苗免疫的同系小鼠的脾及淋巴結(jié)的淋巴細胞做為腫瘤抗原特異性淋巴細胞過繼,同時用mIL-21瘤苗免疫,7 d后以野生型Sp2/0細胞攻擊,觀察小鼠的腫瘤生長情況。FCM分析CD4+、CD8+、CD4+CD25+T細胞亞群的變化,分別以CFSE和7-AAD標記,FCM檢測淋巴

10、細胞增殖能力和效應(yīng)細胞的細胞毒活性,ELISpot檢測分泌IFN-γ的淋巴細胞的數(shù)量。 結(jié)果：與對照組相比,Cy預(yù)處理的小鼠接受過繼效應(yīng)細胞聯(lián)合mIL-21瘤苗免疫可有效的抵抗野生型Sp2/0細胞的攻擊。過繼的腫瘤特異性淋巴細胞的體內(nèi)增殖能力和體外殺傷活性顯著增強,分泌IFN-γ的效應(yīng)細胞的數(shù)量顯著增高。 結(jié)論：在淋巴細胞減少期過繼mIL-21瘤苗致敏的腫瘤抗原特異性淋巴細胞并同時給予mIL-21瘤苗免疫,利于輸入的效應(yīng)