mIL-21瘤苗在腫瘤過(guò)繼免疫治療中作用的研究.pdf

1、過(guò)繼免疫治療可將大量體外擴(kuò)增、活化的腫瘤抗原特異性免疫效應(yīng)細(xì)胞迅速傳遞給患者,釋放調(diào)控宿主免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子和補(bǔ)充內(nèi)源性免疫效應(yīng)細(xì)胞,增強(qiáng)患者的細(xì)胞免疫功能,又可選擇性地抑制、殺傷腫瘤細(xì)胞,是目前治療惡性腫瘤的一個(gè)重要有效的輔助治療方法。但同時(shí)也面臨多種因素影響該策略的治療效果,包括：如何在體外獲得足夠數(shù)量的具有腫瘤殺傷效應(yīng)的特異性免疫活性細(xì)胞,如何促進(jìn)輸注細(xì)胞在體內(nèi)存活、增殖并增強(qiáng)其腫瘤特異性的殺傷活性。 本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建的m

2、IL-21-Sp2/0瘤苗細(xì)胞,可穩(wěn)定表達(dá)mIL-21。且前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明了其可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生有效的抗腫瘤作用。隨著近期IL-21研究的不斷深入,其具有的多重的免疫調(diào)節(jié)功能也越發(fā)引起廣泛關(guān)注。尤其是在促進(jìn)CD8+T細(xì)胞活化增殖,增強(qiáng)CTL細(xì)胞的活性及減少抗原特異性淋巴細(xì)胞凋亡中的所起的作用。 鑒于上述理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),本研究充分利用mIL-21-Sp2/0瘤苗的優(yōu)勢(shì),首先以mIL-21-Sp2/0瘤苗細(xì)胞代替腫瘤細(xì)胞作

3、為刺激抗原,進(jìn)行腫瘤特異性CTL的體外培養(yǎng),以改善原有混合淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)(mixed lymphocyte tumor cell culture,MLTC)方法中的腫瘤細(xì)胞普遍存在免疫原性或抗原遞呈能力弱的缺點(diǎn),為體外誘導(dǎo)特異性效應(yīng)細(xì)胞的增殖提供了新的思路。 其次利用穩(wěn)態(tài)驅(qū)動(dòng)增殖的理論,通過(guò)大劑量的環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)宿主鼠的淋巴細(xì)胞急劇減少,借以改善腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫耐受和抑制的微環(huán)境,使得輸注的效應(yīng)細(xì)胞可以更好地在宿主體內(nèi)增

4、殖、存活。并且根據(jù)在自穩(wěn)增殖早期接觸抗原利于效應(yīng)細(xì)胞形成與維持長(zhǎng)期特異性免疫記憶能力的觀點(diǎn),在過(guò)繼腫瘤特異性淋巴細(xì)胞的同時(shí)再給予mIL-21瘤苗免疫,以期提高過(guò)繼免疫治療的抗腫瘤效果。并通過(guò)對(duì)過(guò)繼細(xì)胞在小鼠體內(nèi)分裂增殖情況、殺傷功能的檢測(cè)和亞群表型變化的分析,對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了探討。 第一部分mIL-21瘤苗免疫致敏的同系鼠淋巴細(xì)胞過(guò)繼荷瘤鼠的抗腫瘤效應(yīng) 目的：篩選表達(dá)mIL-21的單克隆瘤苗細(xì)胞株,觀察使用mIL-21瘤苗

5、免疫小鼠的脾及淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞過(guò)繼荷瘤鼠的抗腫瘤效果。 方法：采用G-418加壓、有限稀釋法獲取表達(dá)mIL-21細(xì)胞株并經(jīng)RT-PCR鑒定。篩選出的瘤苗細(xì)胞接種小鼠,一周后取小鼠脾及淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞,尾靜脈過(guò)繼同系Sp2/0細(xì)胞致瘤的荷瘤鼠,觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況及小鼠存活期。結(jié)果：篩選的mIL-21瘤苗細(xì)胞的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明有mIL-21基因表達(dá),其免疫小鼠的淋巴細(xì)胞過(guò)繼給同系荷瘤宿主,可見(jiàn)一定的抗腫瘤活性,腫瘤生長(zhǎng)及存活期

6、等觀察指標(biāo)優(yōu)于其它對(duì)照組。 結(jié)論:mIL-21-Sp2/0瘤苗細(xì)胞免疫小鼠的淋巴細(xì)胞過(guò)繼至荷瘤宿主體內(nèi)可產(chǎn)生一定的抗腫瘤免疫應(yīng)答,可用作過(guò)繼免疫治療的效應(yīng)細(xì)胞。 第二部分:mIL-21瘤苗細(xì)胞體外對(duì)鼠腫瘤特異性淋巴細(xì)胞增殖及功能的影響 目的：研究表達(dá)mIL-21的Sp2/0細(xì)胞與以滅活Sp2/0細(xì)胞預(yù)先免疫小鼠的淋巴細(xì)胞體外共培養(yǎng),是否對(duì)預(yù)致敏淋巴細(xì)胞增殖及功能有影響。 方法：獲取滅活Sp2/0細(xì)胞免疫小

7、鼠的淋巴細(xì)胞,在mIL-2存在的條件下,以mIL-21轉(zhuǎn)染的Sp2/0細(xì)胞為刺激細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)(FCM),檢測(cè)CFSE標(biāo)記的淋巴細(xì)胞增殖和7-AAD標(biāo)記的細(xì)胞毒活性；用ELISpot法確定分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞數(shù)量。 結(jié)果：轉(zhuǎn)染mIL-21的Sp2/0細(xì)胞對(duì)預(yù)致敏的淋巴細(xì)胞增殖有明顯影響,活化的淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率與對(duì)照組相比有顯著增加,達(dá)35.57±4.72％(p<0.05),且分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量明顯增加。活化

8、增殖后的淋巴細(xì)胞回輸至環(huán)磷酰胺預(yù)處理的小鼠,能產(chǎn)生針對(duì)該腫瘤細(xì)胞良好的保護(hù)作用,延長(zhǎng)小鼠的成瘤時(shí)間。 結(jié)論：表達(dá)mIL-21的Sp2/0細(xì)胞在體外可有效促進(jìn)腫瘤抗原特異性淋巴細(xì)胞活化及增殖,并增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷功能。 第三部分：過(guò)繼腫瘤特異性淋巴細(xì)胞聯(lián)合mIL-21瘤苗免疫抗腫瘤效應(yīng)的研究 目的：探討環(huán)磷酰胺(Cy)誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞減少的狀態(tài)下,過(guò)繼mIL-21轉(zhuǎn)染的瘤苗細(xì)胞(mIL-21-Sp2/0)免疫致

9、敏的同系小鼠腫瘤抗原特異性淋巴細(xì)胞,并聯(lián)合mIL-21-Sp2/0瘤苗免疫抗腫瘤效應(yīng)的機(jī)制。 方法：Cy處理BALB/c小鼠,末次注射兩天后,以滅活mIL-21瘤苗免疫的同系小鼠的脾及淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞做為腫瘤抗原特異性淋巴細(xì)胞過(guò)繼,同時(shí)用mIL-21瘤苗免疫,7 d后以野生型Sp2/0細(xì)胞攻擊,觀察小鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況。FCM分析CD4+、CD8+、CD4+CD25+T細(xì)胞亞群的變化,分別以CFSE和7-AAD標(biāo)記,FCM檢測(cè)淋巴

10、細(xì)胞增殖能力和效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒活性,ELISpot檢測(cè)分泌IFN-γ的淋巴細(xì)胞的數(shù)量。 結(jié)果：與對(duì)照組相比,Cy預(yù)處理的小鼠接受過(guò)繼效應(yīng)細(xì)胞聯(lián)合mIL-21瘤苗免疫可有效的抵抗野生型Sp2/0細(xì)胞的攻擊。過(guò)繼的腫瘤特異性淋巴細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力和體外殺傷活性顯著增強(qiáng),分泌IFN-γ的效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量顯著增高。 結(jié)論：在淋巴細(xì)胞減少期過(guò)繼mIL-21瘤苗致敏的腫瘤抗原特異性淋巴細(xì)胞并同時(shí)給予mIL-21瘤苗免疫,利于輸入的效應(yīng)