β2腎上腺素受體激動(dòng)劑對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、持續(xù)性心肌缺血將導(dǎo)致心肌組織嚴(yán)重?fù)p傷、甚至細(xì)胞死亡。及時(shí)開通閉塞血管、實(shí)現(xiàn)再灌注是挽救缺血心肌損傷最有效方法,但研究顯示再灌注卻可加重心肌細(xì)胞的損傷,即缺血-再灌注損傷。因此,心臟缺血-再灌注損傷目前仍是經(jīng)皮穿刺冠脈腔內(nèi)成形術(shù)、冠脈搭橋術(shù)、心臟移植術(shù)、各種冠脈再通術(shù)后一個(gè)重要的并發(fā)癥,也是導(dǎo)致心臟功能遠(yuǎn)期預(yù)后不良的主要原因之一,有關(guān)其機(jī)制和保護(hù)措施的研究一直倍受關(guān)注。
　　心肌β腎上腺能受體(β-adrenergic recept

2、or,β-AR)介導(dǎo)的信號(hào)傳遞系統(tǒng)與心功能有著密切的關(guān)系。研究表明,心肌的缺血再灌注損傷與交感神經(jīng)及心臟腎上腺素受體過度興奮,增加心肌耗氧量有關(guān),其最終導(dǎo)致氧自由基的形成、心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載和細(xì)胞凋亡,因而造成心肌損傷。
　　既往一直認(rèn)為心臟β-AR與β-AR都是偶聯(lián)Gs蛋白,通過Gs-AC-cAMP的信號(hào)途徑調(diào)節(jié)心肌功能,甚至認(rèn)為β-AR只是β-AR的一個(gè)功能儲(chǔ)備。但近來研究發(fā)現(xiàn)β-AR可同時(shí)與G和G的混雜偶聯(lián),使其具有調(diào)節(jié)心臟功

3、能的平衡作用。研究表明在衰竭心臟和缺血心臟的病情發(fā)展中β2-AR起著不可忽視的作用。
　　同時(shí),眾多研究認(rèn)為刺激β-AR會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡,而刺激β-AR會(huì)逆轉(zhuǎn)促細(xì)胞凋亡的一些信號(hào),使細(xì)胞免受促細(xì)胞凋亡因素的入侵,包括低氧和活性氧家族,其凈效應(yīng)是促使細(xì)胞存活。Steve等研究表明選擇性地β-AR激動(dòng)劑clenbuterol可通122過β-AR/G信號(hào)途徑,改善心肌病理性的損害,減輕凋亡對(duì)心肌的損害。因此,研究結(jié)果提示β-AR信號(hào)通

4、路可能在心肌缺血再灌注損傷的調(diào)節(jié)中起重要作用。但是,β-AR激動(dòng)劑是否對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用,目前尚無報(bào)道。因此,本學(xué)位論文就β-AR激動(dòng)劑clenbuterol對(duì)離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用進(jìn)行研究,由二部分組成:①Clenbuterol對(duì)大鼠缺血/再灌注后心肌2 i222損傷的保護(hù)作用及機(jī)理探討;②Clenbuterol對(duì)H O誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究。若能夠明確β-AR激動(dòng)劑確實(shí)能防止再灌注心肌細(xì)胞

5、損傷,則可以針對(duì)性地激活β-AR發(fā)揮心肌保護(hù)作用,從而為有效地防治缺血再灌注心肌開辟了一個(gè)嶄新的空間。
　　第一部分β2-AR激動(dòng)劑對(duì)離體大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)理探討
　　心肌缺血-再灌注損傷與心臟β1-AR-Gs-AC-cAMP過度興奮相關(guān),β-AR在心肌細(xì)胞可通過β-AR/G偶聯(lián)局限Gs偶聯(lián)介導(dǎo)的cAMP-PKA信號(hào)。因而,β-AR激動(dòng)劑可能改善心臟縮舒功能。此外,氧自由基是心肌缺血-再灌注損傷重要的發(fā)病機(jī)

6、制,它們與β-AR及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否有內(nèi)在的聯(lián)系。同時(shí),2 i22細(xì)胞凋亡參與心肌缺血-再灌注損傷的過程,激動(dòng)β-AR是否能拮抗缺血-再灌注心肌細(xì)胞凋亡,目前相關(guān)研究尚少。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)就β-AR激動(dòng)劑clenbuterol對(duì)大鼠離2體心肌缺血-再灌注損傷的作用及其可能的作用機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　方法:
　　采用Langendorff離體心臟灌流模型,全心停灌30min復(fù)灌60min建立缺血再灌注模

7、型,分別于缺血前10min預(yù)先給予選擇性β2-AR激動(dòng)劑Clenbuterol(1umol/L)和選擇性β2-AR阻斷劑ICI118,551(30nmol/L),經(jīng)多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄灌流過程中左心室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓上升最大速率(+dp/dtmax)、左室內(nèi)壓下降最大速率(-dp/dtmax)和心率(HR)的動(dòng)態(tài)變化,并收集冠脈流出液,記錄平衡灌流末和再灌注第20、30、40、50、60m

8、in時(shí)間點(diǎn)的冠脈流量(CF),測(cè)定冠脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)和一氧化氮(NO)含量。測(cè)定心肌組織超氧化物歧物酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量;免疫組化法檢測(cè)iNOS,eNOS蛋白表達(dá);檢查心肌的組織學(xué)檢查。應(yīng)用TUNEL法進(jìn)行心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè),通過免疫蛋白印跡法測(cè)定凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達(dá),RT-PCR檢測(cè)Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　模型組,HR、LVSP、±dp/

9、dtmax、CF、較對(duì)照組均降低,LVEDP有所增加。冠脈流出液中LDH的含量升高,心肌組織MDA生成增加,SOD活性下降。心肌纖維可見排列不規(guī)則,結(jié)構(gòu)紊亂,肌纖維空隙增寬,并可見部分心肌細(xì)胞出現(xiàn)溶解、壞死。此外,模型組冠脈流出液NO含量下降,eNOS的免疫組織化學(xué)陽性物質(zhì)顯著性減少,各組組織切片的iNOS免疫組織化學(xué)染色均未獲得陽性結(jié)果。TUNEL結(jié)果顯示,模型組心肌細(xì)胞凋亡程度顯著增加,Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)有所下降,而Ba

10、x mRNA和蛋白表達(dá)明顯增多;caspase-3蛋白表達(dá)顯著增多。
　　與模型組比較,β2-AR激動(dòng)劑clenbuterol組可明顯減輕心肌缺血再灌注損傷,表現(xiàn)為降低LVEDP,升高CF,SOD活力、NO含量增加,MDA、LDH含量、心肌病理性損傷均不同程度降低,eNOS蛋白表達(dá)增加,心肌細(xì)胞凋亡率減少,Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)上升,而Bax mRNA和蛋白、caspase-3蛋白表達(dá)下降。以上的作用均可被選擇性β2-AR

11、阻斷劑ICI118,551不同程度阻斷。
　　結(jié)論:
　　1.Clenbuterol可使LVEDP下降,增加冠脈流量,提示Clenbuterol可能通過激動(dòng)血管平滑肌的β2-AR,擴(kuò)張冠脈,從而改善心臟的舒張功能,減少心臟作功,進(jìn)而改善心肌氧的供求關(guān)系。
　　2.Clenbuterol可減輕自由基對(duì)心肌細(xì)胞的損傷,抗脂質(zhì)過氧化,降低心肌酶的釋放,從而改善缺血再灌注心肌能量代謝障礙。
　　3.Clenbuterol

12、可顯著改善缺血再灌注心肌組織的NO生成和eNOS表達(dá),提示Clenbuterol的心肌保護(hù)作用與NO有關(guān)。
　　4.Clenbuterol增加Bcl-2表達(dá),降低Bax表達(dá),上調(diào)Bcl-2/Bax表達(dá),下調(diào)caspase-3的表達(dá),從而抑制缺血再灌注后心肌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)心肌細(xì)胞存活。
　　第二部分β2-AR激動(dòng)劑對(duì)心肌細(xì)胞H2O2損傷的保護(hù)作用
　　研究發(fā)現(xiàn),心臟疾病時(shí)(如缺血-再灌注、心肌梗塞、心衰、心室肥大等)細(xì)胞

13、內(nèi)活性氧水平增加和抗氧化劑水平的降低能直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此,氧化應(yīng)激-心肌細(xì)胞凋亡-心臟疾病之間有著密切的聯(lián)系。基于前一部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,β2-AR激動(dòng)劑clenbuterol能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡,而氧自由基與細(xì)胞凋亡的關(guān)系密切。
　　目的:
　　本研究通過外源性H2O2作用于培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞,來探討clenbuterol對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和凋亡的保護(hù)作用。
　　方法:
　　建立H2O2所致原代新

14、生大鼠心肌細(xì)胞損傷模型,通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞存活率、LDH、MDA含量和SOD活性測(cè)定,研究clenbuterol對(duì)H2O2損傷心肌細(xì)胞的抗氧化作用;通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的變化、免疫組化檢測(cè)caspase-3蛋白表達(dá),Western Blotting檢測(cè)磷酸化Akt蛋白的表達(dá),研究clenbuterol對(duì)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.單獨(dú)給予clenbuterol組各項(xiàng)指標(biāo)與正常心肌

15、細(xì)胞比較無顯著性差異。模型組心肌心肌細(xì)胞存活率較正常組下降,LDH活性、MDA含量顯著增高,SOD活性較正常組心肌細(xì)胞下降。Clenbuterol+H2O2組心肌細(xì)胞存活率、SOD活性較模型組顯著增高,而LDH活性、MDA含量較模型組明顯降低,選擇性β2-AR阻斷劑ICI118,551可抑制clebuterol的保護(hù)作用。
　　2.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Clenbuterol+H2O2可使心肌細(xì)胞的凋亡率、caspase-3表達(dá)量減少,

16、磷酸化Akt表達(dá)量較模型組增加,而阻斷劑ICI118,551組可抑制clenbuterol的抗凋亡作用。
　　結(jié)論:
　　1.0.1mM H2O2對(duì)心肌細(xì)胞具有損傷作用,表現(xiàn)心肌細(xì)胞存活率降低,形態(tài)學(xué)發(fā)生改變,增加LDH活性、MDA含量,降低SOD活性,使心肌細(xì)胞受到氧自由基損傷,并誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　2. Clenbuterol可拮抗0.1mM H2O2誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡,對(duì)氧化損傷的心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用。