肺癌轉移相關蛋白1(LCMR1)與細胞凋亡關系的研究.pdf

1、目的:肺癌轉移相關蛋白1(lungcancermetastasisrelatedprotein1,LCMR1)的編碼基因是我們實驗室采用差異顯示技術(DDRT-PCR)克隆到的新基因(GenBankID:AY148462)。目前,其生物學功能尚不十分清楚。我們在前期研究中,通過蛋白-蛋白相互作用方法找到LCMR1相互作用蛋白DEK。本實驗擬進一步揭示LCMR1與DEK的結合區(qū)域,并借助相互作用蛋白DEK功能區(qū)提供的線索,開展LCMR1功

2、能研究,探討其在細胞凋亡中的作用及作用機制,為在基因水平預防和治療肺癌尋找新的分子靶點,為抗癌藥物的研發(fā)和肺癌治療提供線索和分子基礎。
　　方法:(1)構建DEK(N端)功能區(qū)質粒及DEK(C端)功能區(qū)質粒,使用TNT兔網織紅細胞裂解液體系,在體外快速轉錄翻譯DEK(N端)功能區(qū)蛋白及DEK(C端)功能區(qū)蛋白。(2)應用大腸桿菌原核表達系統(tǒng),以pGEX-5T質粒及pGEX-5T-LCMR1質粒為模板,誘導表達GST蛋白及GST-L

3、CMR1融合蛋白。(3)采用GST融合蛋白沉降(GSTPull-down)技術,研究LCMR1與DEK(N端)功能區(qū)、DEK(C端)功能區(qū)的結合情況,并借助DEK功能區(qū)提供的線索,初步推測LCMR1功能。(4)采用小干擾RNA技術敲減LCMR1,采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)及蛋白印跡(WesternBlot)方法,在mRNA水平及蛋白水平驗證LCMR1下調效果。(5)采用流式細胞術及PI染色法,檢測LCMR1下調后95D細胞

4、系、A549細胞系及H1299細胞系中凋亡細胞數量的變化;采用WesternBlot方法,檢測LCMR1下調后細胞凋亡相關蛋白caspase-3、caspase-8及caspase-9表達量變化;采用分光光度法檢測LCMR1下調后細胞凋亡相關蛋白caspase-3,caspase-8及caspase-9活性變化;采用qRT-PCR及WesternBlot方法,檢測LCMR1下調后細胞Bax,Bid及Mcl-1mRNA水平和蛋白水平變化。

5、
　　結果:(1)成功構建DEK功能區(qū)質粒,并在體外成功轉錄翻譯功能區(qū)蛋白。(2)成功原核誘導表達并純化GST蛋白及GST-LCMR1蛋白。(3)通過GSTpull-down實驗證實,LCMR1與DEK(N端)功能區(qū)有相互作用,LCMR1與DEK(C端)功能區(qū)無相互作用。(4)從mRNA水平和蛋白水平驗證了設計的LCMR1小干擾RNA對LCMR1有明顯的敲減效果。(5)LCMR1與細胞凋亡關系研究發(fā)現,LCMR1下調導致:①凋亡細

6、胞增加并出現明顯凋亡峰;②活化的Caspase-3蛋白表達增加、活性增強。(6)LCMR1的凋亡機制研究發(fā)現,LCMR1下調導致:①活化的Caspase-8蛋白及活化的Caspase-9蛋白表達增多、活性增強;②肺腺癌A549(p53+/+)細胞凋亡增加,肺腺癌H1299(p53-/-)細胞凋亡無明顯增加;③促凋亡因子Bax及Bid表達升高,抑凋亡因子Mcl-1表達下降。
　　結論:(1)LCMR1與DEK(N端)功能區(qū)有相互作用