IGF-1R旁路相關miRNA與非小細胞肺癌EGFR-TKIs耐藥關系的研究.pdf

1、目的:
　　1.利用小干擾 RNA(siRNA)沉默耐吉非替尼 A549（A549/GR）細胞的胰島素生長因子1受體（IGF-1R）基因,為進一步探討IGF-1R信號通路的激活對肺腺癌表皮生長因子受體抑制劑（EGFR-TKIs）的耐藥性研究提供細胞模型;
　　2.探討IGF-1R旁路相關微小RNA（miRNA）與EGFR-TKIs耐藥的關系。
　　方法:
　　1. A549/GR由前期實驗獲得，復蘇A549/GR

2、細胞，CCK-8法測定A549/GR對A549的耐藥倍數；
　　2.設計并化學合成針對IGF-1R基因編碼區(qū)的siRNA3對，并以1對無關序列的寡核苷酸作為陰性對照。將化學合成siRNA用脂質體介導法轉染至A549/GR細胞，實驗分為6組：siRNA-1組、siRNA-2組siRNA-3組、陰性對照組、陽性對照組、空白對照組。轉染后48h應用Real-time PCR方法檢測IGF-1R siRNA轉染的基因干擾效率;
　　

3、3.miRNA芯片檢測A549/GR與IGF-1R-siRNA-A549/GR中miRNA的表達差異。
　　4.RT-PCR驗證miRNA芯片結果。
　　結果:
　　1. CCK-8法測得A549/GR細胞的耐藥指數為親代細胞的6.00倍；A549/GR細胞倍增時間較A549細胞縮短（31.97h VS.34.85 h，p＜0.01）；
　　2.成功構建了 IGF-1R基因表達沉默的 A549/GR細胞株模型，R

4、T—PCR結果顯示siRNA實驗組與空白對照組相比IGF-1R mRNA的的表達水平均明顯降低，差異有統計學意義，其中siRNA-2組的沉默效率最高，為72％;
　　3.通過對A549/GR與IGF-1R-siRNA-A549/GR中miRNA表達譜進行數據分析，P＜0.05的miRNAs有72條，其中在IGF-1R-siRNA-A549/GR中上調的有13條，包括miR-497-3p、miR-1273c等；下調的有59條，包括m

5、iR-361-3p、miR-345-3p等;
　　4.將miRNA芯片中差異表達較顯著且信號值較高的10條miRNAs進一步采用RT-PCR驗證，其中10條均與芯片結果一致。
　　結論:
　　1.成功建立了IGF-1R基因表達沉默的人肺腺癌A549/GR細胞株模型。
　　2. miRNA芯片是篩選差異表達miRNA的有效工具。
　　3.IGF-1R沉默組與對照組miRNA表達差異顯著，IGF-1R旁路相關m