pcsk9基因功能獲得型和缺失型突變真核表達(dá)載體的構(gòu)建及初步鑒定.pdf

1、目的: 構(gòu)建pcsk9功能獲得型突變與功能缺失型突變基因真核表達(dá)載體，并完成初步鑒定，為明確pcsk9與內(nèi)皮細(xì)胞損傷和泡沫細(xì)胞形成的具體聯(lián)系提供研究手段，為研究As機(jī)制及防治提供新的思路。
　　方法: 1.培養(yǎng)人肝細(xì)胞株（BLE7402），收集細(xì)胞提取RNA，去除DNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。以cDNA第1鏈為模板，擴(kuò)增pcsk9基因編碼區(qū)全長(zhǎng)，鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。按照Target clone-plus試劑盒操作說(shuō)明對(duì)pcsk9進(jìn)行

2、加A反應(yīng)，純化，將pcsk9 cDNA與pMD18-T載體連接。將pMD18-T-pcsk9載體轉(zhuǎn)化入DH-5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，利用含AmpLB的固體平板倒置培養(yǎng)，挑取單克隆，搖菌，提取質(zhì)粒，Hind III和XbaI酶切，測(cè)序鑒定。提取pMD18-T- pcsk9，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增，在其3’端添加Flag標(biāo)簽，酶切，純化。同法將pcDNA4.0轉(zhuǎn)化擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，酶切純化后與pcsk9-Flag連接，構(gòu)建pcDNA4.0-pcsk9質(zhì)

3、粒，去除內(nèi)毒素。2.選擇pcsk9獲得型突變（S127R）與缺失型突變(L253F)，分別設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物，以野生型pcsk9載體為模板定點(diǎn)誘變，構(gòu)建pcsk9兩種突變型真核表達(dá)載體。如上將突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌XL10GOLD，提取質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證并去除內(nèi)毒素。3.培養(yǎng)THP-1細(xì)胞至最佳狀態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)，分入24孔板。按照Lipofectamine?LTX轉(zhuǎn)染說(shuō)明，分別pcsk9野生型質(zhì)粒、pcsk9- S127R質(zhì)粒、pcsk9-

4、L253F質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入THP-1細(xì)胞，24小時(shí)后用佛波酯誘導(dǎo)，并在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。4.利用RT-PCR、Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后THP-1細(xì)胞pcsk9 mRNA和蛋白、LDLR表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功。
　　結(jié)果: 提取總RNA，取5ml稀釋100倍測(cè)OD值為1.9，電泳發(fā)現(xiàn)28S rRNA、18S rRNA條帶清晰，前者亮度約為后者1.5-2.0倍，5S rRNA條帶模糊。擴(kuò)增pcsk9基因編碼區(qū)全

5、長(zhǎng)，電泳圖上發(fā)現(xiàn)2.1kb左右的條帶，與pcsk9基因編碼區(qū)（2079bp）大小相符。 pMD18-T- pcsk9載體轉(zhuǎn)化16h，出現(xiàn)散在白色菌落?；驕y(cè)序發(fā)現(xiàn)所測(cè)基因與pcsk9同一性100％，堿基缺失率0%。
　　構(gòu)建pcsk9野生型真核表達(dá)載體，酶切電泳發(fā)現(xiàn)2.1 kb和5.1 kb處分別出現(xiàn)條帶，與pcsk9基因（2079bp）和pcDNA4.0（5078bp）載體大小相符。構(gòu)建功能獲得型突變pcDNA4.0-pcsk9

6、-S127R真核表達(dá)載體，測(cè)序發(fā)現(xiàn)pcsk9DNA第381位堿基由T變成A，構(gòu)建功能缺失型突變pcDNA4.0-pcsk9-L253F真核表達(dá)載體，測(cè)序發(fā)現(xiàn)pcsk9 DNA第757位堿基由C變成T。
　　將pcsk9野生型質(zhì)粒、pcsk9-S127R質(zhì)粒、pcsk9-L253F質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入THP-1，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組無(wú)發(fā)綠色熒光細(xì)胞，pcsk9野生型質(zhì)粒組、pcsk9-S127R質(zhì)粒組、pcsk9-L253F質(zhì)粒組有發(fā)

7、綠色熒光細(xì)胞。
　　檢測(cè)轉(zhuǎn)染后 THP-1 pcsk9mRNA表達(dá)情況，電泳發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組無(wú)條帶， pcsk9野生型質(zhì)粒組、pcsk9- S127R質(zhì)粒組、pcsk9- L253F質(zhì)粒組有大小相似條帶。
　　檢測(cè)轉(zhuǎn)染后THP-1 PCSK9蛋白表達(dá)情況，Western blot分析發(fā)現(xiàn)60KD處（PCSK9）正常對(duì)照組無(wú)條帶，pcsk9野生型質(zhì)粒組、pcsk9-S127R質(zhì)粒組、pcsk9-L253F質(zhì)粒組有大小相似條帶。<

8、br>　　檢測(cè)轉(zhuǎn)染后 THP-1 LDLR蛋白表達(dá)情況，Western blot分析發(fā)現(xiàn)93KD處（LDLR大?。┨巔csk9-L253F質(zhì)粒組條帶灰度值最大，正常對(duì)照組次之，pcsk9野生型質(zhì)粒組第三，pcsk9-S127R質(zhì)粒組最小，方差分析，發(fā)現(xiàn)組間差異有顯著性（p<0.05）。
　　結(jié)論: 構(gòu)建了pcsk9功能獲得型（S127R）和功能缺失型（L253F）突變真核表達(dá)載體，并驗(yàn)證其構(gòu)建成功，為明確pcsk9與內(nèi)皮損傷和泡沫