呼吸道感染患兒超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的耐藥性及基因重組菌株的抗藥活性分析.pdf

1、背景：
　　呼吸道感染是小兒時(shí)期最常見(jiàn)的疾病,細(xì)菌是其感染的重要致病原。β-內(nèi)酰胺類抗生素是兒科首選的抗感染治療藥物,在其選擇性壓力下,細(xì)菌產(chǎn)生了超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)。產(chǎn)酶細(xì)菌具有多種耐藥基因,對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥,不同國(guó)家和地區(qū)、不同時(shí)期,產(chǎn)酶菌株的分布、所含的耐藥基因及產(chǎn)生的抗藥活性不盡相同。
　　目前,ESBLs菌株所產(chǎn)的酶型已超過(guò)700余種,主要包括TEM型、SHV型、CTX-M型及其它少見(jiàn)類型,各型及亞

2、型間酶的耐藥性有所差異。自2000年后,CTX-M型酶逐漸替代TEM型、SHV型酶,成為全球流行的主要酶型。對(duì)頭孢他啶敏感、對(duì)頭孢噻肟耐藥,是產(chǎn)CTX-M型酶細(xì)菌的主要耐藥特征。如何合理選用抗生素,如何能更有效地檢測(cè)、治療產(chǎn)酶菌株的感染、防止其流行,是我們臨床上亟待解決的問(wèn)題。
　　目的：
　　1.了解西安地區(qū)呼吸道感染患兒產(chǎn)ESBLs細(xì)菌總的耐藥特征。
　　2.了解西安地區(qū)呼吸道感染患兒產(chǎn)ESBLs細(xì)菌的耐藥基因分布

3、情況。
　　3.通過(guò)對(duì)流行的主要酶型作原核表達(dá),了解單一酶型產(chǎn)酶菌株的耐藥特征,為臨床特異性診斷及治療其感染奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.對(duì)2011.7—2012.10我院住院的呼吸道感染患兒行咽拭子及痰細(xì)菌培養(yǎng),分離獲得ESBLs陽(yáng)性細(xì)菌,用K-B紙片擴(kuò)散法檢測(cè)其對(duì)抗生素的耐藥狀況。
　　2.設(shè)計(jì)TEM、SHV、CTX-M-1組、CTX-M-2組、CTX-M-9組基因型引物,PCR方法檢測(cè)ESBLs細(xì)菌的耐藥

4、基因分布情況,并通過(guò)基因測(cè)序獲得西安地區(qū)現(xiàn)階段流行的ESBLs耐藥基因亞型。
　　3.通過(guò)基因重組技術(shù)構(gòu)建原核表達(dá)載體,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸感受態(tài)細(xì)胞,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)單一酶型的ESBLs,用K-B紙片擴(kuò)散法分析其抗藥活性。
　　結(jié)果：
　　1.呼吸道感染患兒中檢出產(chǎn)ESBLs細(xì)菌共47株,主要為大腸埃希菌26株和肺炎克雷伯菌21株(產(chǎn)酶率分別為52.0％,47.7%)。產(chǎn)酶細(xì)菌對(duì)頭孢類抗生素高度耐藥(頭孢他啶、頭孢呋

5、辛、頭孢噻肟、頭孢曲松耐藥率為100%),對(duì)頭孢吡肟部分耐藥(耐藥率26.9%~38.1%);對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素/酶抑制劑復(fù)合物耐藥率有差異(依次為氨芐西林/舒巴坦38.5%~85.7%、頭孢哌酮/舒巴坦19.2%~28.6%、哌拉西林/他唑巴坦7.7~14.3%);對(duì)亞胺培南及美洛培南耐藥率為0。
　　2.產(chǎn)ESBLs細(xì)菌耐藥基因型流行以CTX-M-9組最多見(jiàn)(51.1%),然后依次為TEM型(29.8%),CTX-M-1組(

6、21.3%),SHV型(10.6%),CTX-M-2組檢出率為0;DNA基因測(cè)序顯示CTX-M-9組基因亞型以CTX-M-14為主。
　　3.重組質(zhì)粒pET32a-CTX-M-14雙酶切鑒定顯示在5900bp及876bp處各見(jiàn)一目的條帶。IPTG誘導(dǎo)BL21-pET32a-CTX-M-14轉(zhuǎn)化菌,SDS-PAGE電泳顯示在33KDa附近處見(jiàn)一目的蛋白;重組CTX-M-14型酶大腸埃希菌菌株的抗藥活性顯示:對(duì)頭孢噻肟、頭孢呋辛、頭孢

7、曲松耐藥,頭孢他啶、頭孢吡肟敏感;對(duì)酶抑制劑均敏感;對(duì)亞胺培南及美洛培南均敏感。
　　結(jié)論：
　　1.兒童呼吸道感染革蘭陰性桿菌產(chǎn)酶嚴(yán)重,主要見(jiàn)于大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌。產(chǎn)ESBLs細(xì)菌具有多重耐藥的表型特征,對(duì)頭孢類抗生素高度耐藥,對(duì)酶抑制劑復(fù)合物部分耐藥,對(duì)碳青霉烯類抗生素尚未發(fā)現(xiàn)耐藥菌株。
　　2.西安地區(qū)呼吸道感染患兒ESBLs細(xì)菌對(duì)廣譜頭孢菌素耐藥的主要原因是產(chǎn)生了CTX-M-9組耐藥基因,其中以CTX-M