海洋硫酸半乳聚糖特異性降解、寡糖和糖脂的制備與序列分析及其寡糖芯片的構(gòu)建.pdf

1、本論文以幾種海洋硫酸半乳聚糖為研究對象，采用酸法和自由基氧化法和現(xiàn)代色譜分離技術(shù)獲得了120種寡糖，通過還原胺化方法制備了30種擬糖脂生物探針，并運(yùn)用生物質(zhì)譜技術(shù)確定了它們的結(jié)構(gòu)序列。 首先，運(yùn)用電噴霧碰撞誘導(dǎo)串聯(lián)質(zhì)譜(ES-CID-MS/MS)技術(shù)，分析了14種不同結(jié)構(gòu)特征的具有代表性的卡拉膠寡糖的序列，總結(jié)了不同寡糖在質(zhì)譜分析中產(chǎn)生的糖基碎片信息，發(fā)現(xiàn)并成功解決了硫酸寡糖質(zhì)譜分析中硫酸根易脫落的問題，找到了不同結(jié)構(gòu)的寡糖二級

2、質(zhì)譜碎片離子的斷裂規(guī)律，從理論上解釋了產(chǎn)生特殊離子碎片的原因，最終建立了硫酸半乳寡糖微量序列分析的質(zhì)譜學(xué)方法。這些規(guī)律同樣適用于其它硫酸寡糖序列分析。所建立的微量寡糖序列分析方法為卡拉膠類寡糖的構(gòu)效關(guān)系研究提供了重要技術(shù)支持。 以κ-、τ-和λ-卡拉膠、瓊膠和脫硫λ-卡拉膠為原料，采用溫和稀酸降解法制備了系列寡糖并用ES-CID-MS/MS技術(shù)確定了其序列。獲得了90個寡糖單體，其中40種寡糖單體為首次報道。從位阻效應(yīng)和環(huán)張力效

3、應(yīng)出發(fā)，以特異酸解條件制備了聚合度3～19的κ-卡拉膠奇數(shù)硫酸寡糖和聚合度3～19的瓊膠奇數(shù)寡糖；根據(jù)3，6-內(nèi)醚半乳糖的酸不穩(wěn)定性，進(jìn)而選用了還原性弱酸降解制備了聚合度2～24的κ-卡拉膠偶數(shù)硫酸寡糖醇與2～20的偶數(shù)瓊膠寡糖醇系列寡糖；根據(jù)C2位硫酸基拉電子誘導(dǎo)效應(yīng)及稀酸對α-1，3和β-1，4糖苷鍵水解選擇性的差異，制備了聚合度2～20的τ-卡拉膠偶數(shù)硫酸寡糖及其糖醇，本技術(shù)具有擬c[.瓊膠酶和α-卡拉膠酶特異性降解特點(diǎn)，但卻制備

4、了結(jié)構(gòu)不同于酶法制備的寡糖化合物，其成本又遠(yuǎn)低于生物酶法。含有3，6-內(nèi)醚半乳糖的多糖易被稀無機(jī)酸和有機(jī)酸以及固體酸如各種酸性陽離子交換樹脂降解而得到全部為奇數(shù)的罕見降解結(jié)果，在大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，首次闡明了這種能夠特異性獲得奇數(shù)寡糖的降解機(jī)理。 在上述降解機(jī)理的指導(dǎo)下，以一種紅藻多糖為原料，采用分步降解法制備了14種雜合寡糖并確定了它們的序列，為復(fù)雜紅藻多糖的結(jié)構(gòu)研究提供了方法學(xué)參考。此外，進(jìn)一步評價了系列雜合硫酸半乳寡糖對

5、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)和β-分泌酶(BACE)抑制活性，結(jié)果顯示：在648μg/mL下，組分M4具有一定抑制ACE活性，抑制率為10.4％，具有弱降壓活性；在100μg/mL下，低分子量組分M1，M2和M3抑制BACE分別為42.5％，31.1％和47.6％，表明具有一定抗老年癡呆活性，但高分子量組分則無活性。該結(jié)果為從事其它硫酸半乳寡糖構(gòu)效關(guān)系的研究、生物活性評價提供了基礎(chǔ)。 在對硫酸半乳多糖的自由基氧化降解實(shí)驗(yàn)中，采用正

6、交實(shí)驗(yàn)設(shè)計法確定了自由基降解的最佳條件，獲得了系列自由基降解產(chǎn)物，并通過質(zhì)譜技術(shù)成功分析了復(fù)雜產(chǎn)物中的寡糖結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，自由基降解是一種非特異性的降解方法，所得寡糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，這為獲得結(jié)構(gòu)豐富多樣且新穎的寡糖提供了有效方法。此外，通過對產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn)，該方法沒有硫酸根的脫落問題，能夠較好的保留多糖分子中的硫酸酯基團(tuán)，有利于某些生物活性的評價。通過此降解方法獲得了3個系列30多種寡糖和雜合硫酸半乳寡糖組分，首次獲得了結(jié)構(gòu)新穎的κ-和τ

7、-卡拉膠寡糖酸。 為了深入研究寡糖與蛋白相互作用，快速篩選活性寡糖化合物，利用上述寡糖為原料，進(jìn)一步采用還原氨胺化技術(shù)探討了擬糖脂生物探針的合成，獲得了30種擬糖脂，并運(yùn)用生物質(zhì)譜技術(shù)確定了它們的結(jié)構(gòu)。這些寡糖脂為糖芯片的構(gòu)建，以及進(jìn)一步從事寡糖與蛋白之間的相互作用研究提供了基礎(chǔ)。 綜上所述，本文以多種硫酸半乳寡糖為研究對象，系統(tǒng)建立了一種微量簡便的生物質(zhì)譜學(xué)方法，該方法能確定各種硫酸半乳寡糖的序列，并在對寡糖產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的