硫酸巖藻聚糖和寡糖結(jié)構(gòu)分析、糖芯片的構(gòu)建及其與流感病毒神經(jīng)氨酸酶作用研究.pdf

1、本論文以褐藻中硫酸巖藻聚糖為研究對(duì)象，制備了硫酸巖藻寡糖及其擬糖脂，建立了硫酸巖藻多糖和寡糖芯片技術(shù)體系，并成功利用所建糖芯片探討了其與流感病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)作用。
　　首先，以厚葉切氏海帶（Kjellmaniella crassifolia）為原料，采用脫脂后水提取及醇沉的方法，對(duì)其中的褐藻糖膠KW進(jìn)行了提取分離，利用醋酸纖維素薄膜電泳(ACME)、高效凝膠滲透色譜(HPGPC)和高效液相色譜(HPLC)等對(duì)其純度、分子量和

2、單糖組成等理化性質(zhì)進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，KW為一種高巖藻糖含量(82％)及高硫酸化（30％硫酸基）的硫酸巖藻聚糖，除了巖藻糖(Fuc)外，還含有少量的甘露糖(Man)和葡萄糖醛酸(GlcA)。經(jīng)進(jìn)一步傅里葉變換紅外光譜(FTIR)、核磁共振波譜(NMR)和甲基化分析表明，KW主要由4-硫酸巖藻糖(F4S)和2，4-二硫酸巖藻糖(F2S4S)組成，巖藻糖殘基之間均通過α1→3連接。采用稀酸分步降解并結(jié)合寡糖質(zhì)譜解析的方法分析KW細(xì)微結(jié)構(gòu)。

3、分析結(jié)果表明，KW含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)不同的區(qū)域，一個(gè)是1→3連接的F4S和F2S4S區(qū)域，另一個(gè)是甘露糖(Man)與葡萄糖醛酸(GlcA)交替連接的結(jié)構(gòu)區(qū)域，采用酸法降解獲得了4糖至20糖，通過NMR和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)確定了9種寡糖結(jié)構(gòu)，GlcAβ1→[2Manα1→4GlcAβ1]n→ Man,n=1-9。
　　利用所得硫酸寡糖，建立了兩步串聯(lián)質(zhì)譜分析策略確定高硫酸化寡糖結(jié)構(gòu)新方法，避免了傳統(tǒng)質(zhì)譜分析硫酸根取代信息缺失問題。將硫酸寡糖分別

4、轉(zhuǎn)成Na型和H型后，先以Na型寡糖為對(duì)象分析寡糖的組成和序列，再以H型寡糖在質(zhì)譜條件下產(chǎn)生的脫硫離子為母離子，分析寡糖的連接方式和硫酸根取代位置，結(jié)合H型和Na型寡糖質(zhì)譜離子碎片信息推出寡糖的完整結(jié)構(gòu)。利用該策略，本文確定了KW經(jīng)酸降解后8種寡糖的結(jié)構(gòu)，即F4S(α1→3) F4S（α1→3）nF4S(α1→3)F4S和F2S4S(α1→3) F4S（α1→3）nF4S(α1→3)F4S，其中n=0-3。結(jié)合所得寡糖結(jié)構(gòu)信息，闡明了KW

5、的酸降解機(jī)理。在酸性環(huán)境下，巖藻糖C2位硫酸根發(fā)生脫落，非硫酸化與硫酸化巖藻糖殘基(Fuc-Fuc4S)之間糖苷鍵的斷裂速度大于單硫酸化與二硫酸化糖殘基(Fuc4S-Fuc2S4S)之間糖苷鍵，且均大于二個(gè)單硫酸化糖殘基(Fuc4S-Fuc4S)之間的斷裂速度，即V(Fuc-Fuc4S)＞ V(Fuc4S-Fuc2S4S)＞ V(Fuc4S-Fuc4S)。
　　以上述結(jié)構(gòu)明確的硫酸寡糖以及其它來源寡糖為原料，采用還原胺化法制備了2

6、1種含有DHPE的開環(huán)巖藻寡糖脂，其中13個(gè)為首次獲得;采用活性肟連接方法，合成了18種含有AOPE的閉環(huán)擬糖脂，其中10個(gè)為首次獲得。
　　以FITC標(biāo)記多糖制備了多糖芯片，以制備的擬寡糖脂為原料，制備了巖藻寡糖mini-糖芯片。采用糖芯片技術(shù)研究了硫酸巖藻糖與H1N1/H3N2/H5N1流感病毒NA蛋白的結(jié)合情況，并在細(xì)胞水平上對(duì)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。得出以下結(jié)論:NA蛋白與糖的結(jié)合方式有多種形式，電荷作用是NA蛋白與糖結(jié)合的必要條