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文檔簡介
1、目的:
構(gòu)建小鼠鋅α2糖蛋白(Zinc-α2-glycoprotein)的重組真核表達載體,并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染3T3-L1前脂肪細胞,研究鋅α2糖蛋白(ZAG)調(diào)控脂肪細胞甘油三酯(ATG)代謝的作用及機制。
方法:
1、提取正常小鼠肝組織總的RNA,通過RT-PCR法擴增mZAG全基因表達序列,雙酶切表達質(zhì)粒pcDNA3.1(-),將擴增后的mZAG全基因表達序列插入空質(zhì)粒中,從而構(gòu)建pcDNA3.1(-)-mZ
2、AG真核表達質(zhì)粒,經(jīng)PCR擴增方法和核苷酸測序驗證后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將pcDNA3.1(-)-mZAG序列轉(zhuǎn)染至3T3-L1前脂肪細胞中,G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株,Western Blot檢測mZAG表達情況并檢測激素敏感脂肪酶(HSL)、脂肪甘油三脂水解酶(ATGL)蛋白表達,RT-PCR檢測HSL、ATGL mRNA表達,ELISA法測定脂肪細胞培養(yǎng)液上清中游離脂肪酸(FFA)濃度。
2、體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞,用
3、含有胰島素、IBMX與地塞米松的分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化細胞,予以重組 ZAG蛋白(20μg/mL)干預(yù)。采用油紅 O染色觀察脂肪細胞內(nèi)脂滴聚集、透射電鏡掃描觀察脂肪細胞線粒體數(shù)目變化及ELISA法測定脂肪細胞培養(yǎng)液上清中FFA濃度。
結(jié)果:
1、mZAG真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-mZAG經(jīng)測序鑒定證實成功構(gòu)建。
2、過表達ZAG組的HSL、ATGL mRNA和蛋白表達水平高于未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(
4、P<0.05)。
3、過表達ZAG組的細胞培養(yǎng)液上清中FFA水平與未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
4、重組ZAG蛋白干預(yù)分化成熟的脂肪細胞48h,細胞培養(yǎng)液上清中FFA濃度低于對照組,差異有顯著性(P<0.05)。脂肪細胞內(nèi)脂滴數(shù)量少、體積小,線粒體數(shù)量增多。
結(jié)論:
1、成功構(gòu)建mZAG真核表達載體,建立ZAG穩(wěn)定表達3T3-L1細胞系。
2、ZAG過表達可上調(diào)
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