突變敏感性分子開(kāi)關(guān)篩查AAID熱點(diǎn)基因突變的條件優(yōu)化與應(yīng)用研究.pdf

1、目的：利用高保真聚合酶結(jié)合硫代磷酸化修飾的特異性檢測(cè)引物構(gòu)成的突變敏感性分子開(kāi)關(guān)，建立能夠準(zhǔn)確、快速識(shí)別mtDNA12S rRNA基因A1555G、C1494T、961delT三個(gè)與AAID密切相關(guān)的熱點(diǎn)突變位點(diǎn)檢測(cè)平臺(tái)。通過(guò)該方法檢測(cè)mtDNA12S rRNA基因A1555G、C1494T、961delT三個(gè)突變位點(diǎn)的有無(wú)，來(lái)指導(dǎo)AmAn的合理用藥，預(yù)防AAID的發(fā)生。
　　方法：以已構(gòu)建好的同時(shí)包含mtDNA12S rRNA基

2、因A1555G、C1494T、961delT三個(gè)位點(diǎn)的突變型質(zhì)粒和野生型質(zhì)粒為模板，利用高保真聚合酶結(jié)合硫代磷酸化修飾的特異性檢測(cè)引物構(gòu)成的突變敏感性分子開(kāi)關(guān)，對(duì)突變型質(zhì)粒模板和野生型質(zhì)粒模板分別進(jìn)行引物延伸反應(yīng)，將其PCR產(chǎn)物通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。通過(guò)調(diào)節(jié)PCR反應(yīng)過(guò)程中退火溫度、引物濃度、模板濃度等，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，然后在同一反應(yīng)體系中對(duì)包含mtDNA12S rRNA基因A1555G、C1494T、961delT三位點(diǎn)突變型

3、質(zhì)粒模板和野生型質(zhì)粒模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，并通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)對(duì)其 PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析。采用優(yōu)化好的多重 PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，確定所建立的檢測(cè)平臺(tái)的靈敏性。最后利用高保真酶介導(dǎo)突變敏感性分子開(kāi)關(guān)對(duì)臨床志愿者的血液基因組DNA樣本進(jìn)行基因突變的篩查。
　　結(jié)果：在一定的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，突變檢測(cè)引物與野生模板不配對(duì)，無(wú)PCR產(chǎn)物，而與突變模板相配對(duì)，則有PCR產(chǎn)物。在優(yōu)化 PCR反應(yīng)退火溫度的過(guò)程中，隨著退火溫度的升高，突變敏

4、感性分子開(kāi)關(guān)的特異性提高。在不同的反應(yīng)體系中，重組質(zhì)粒經(jīng)定量后，稀釋成108、107、106、105、104、103、102、101拷貝/μL濃度梯度作為模板，然后再以稀釋的質(zhì)粒分別作為模板，本課題所構(gòu)建的突變敏感性分子開(kāi)關(guān)檢測(cè)平臺(tái)對(duì)于A1555G、C1494T的檢測(cè)靈敏度達(dá)到103拷貝，特異性達(dá)到106拷貝，961delT的檢測(cè)靈敏度達(dá)到102拷貝，特異性達(dá)到105拷貝，在同一反應(yīng)體系的多重引物延伸反應(yīng)中，對(duì)三位點(diǎn)突變進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，突

5、變重組質(zhì)粒經(jīng)定量后，稀釋成108、107、106、105、104、103、102、101拷貝/μL濃度梯度作為模板，本課題所構(gòu)建的突變敏感分子開(kāi)關(guān)檢測(cè)平臺(tái)對(duì)于三位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)的靈敏度達(dá)到104拷貝。突變敏感性分子開(kāi)關(guān)對(duì)50例臨床志愿者mtDNA12S rRNA基因 A1555G、C1494T、961delT突變的篩查均沒(méi)有發(fā)現(xiàn) A1555G、C1494T、961delT突變攜帶者。
　　結(jié)論：利用突變敏感性分子開(kāi)關(guān)技術(shù)，建立了快速篩