突變敏感性分子開關篩查AAID熱點基因突變的條件優(yōu)化與應用研究.pdf

1、目的：利用高保真聚合酶結合硫代磷酸化修飾的特異性檢測引物構成的突變敏感性分子開關，建立能夠準確、快速識別mtDNA12S rRNA基因A1555G、C1494T、961delT三個與AAID密切相關的熱點突變位點檢測平臺。通過該方法檢測mtDNA12S rRNA基因A1555G、C1494T、961delT三個突變位點的有無，來指導AmAn的合理用藥，預防AAID的發(fā)生。
　　方法：以已構建好的同時包含mtDNA12S rRNA基

2、因A1555G、C1494T、961delT三個位點的突變型質粒和野生型質粒為模板，利用高保真聚合酶結合硫代磷酸化修飾的特異性檢測引物構成的突變敏感性分子開關，對突變型質粒模板和野生型質粒模板分別進行引物延伸反應，將其PCR產(chǎn)物通過凝膠成像系統(tǒng)進行分析。通過調節(jié)PCR反應過程中退火溫度、引物濃度、模板濃度等，優(yōu)化PCR反應條件，然后在同一反應體系中對包含mtDNA12S rRNA基因A1555G、C1494T、961delT三位點突變型

3、質粒模板和野生型質粒模板進行PCR反應，并通過凝膠成像系統(tǒng)對其 PCR產(chǎn)物進行分析。采用優(yōu)化好的多重 PCR反應條件和反應體系，確定所建立的檢測平臺的靈敏性。最后利用高保真酶介導突變敏感性分子開關對臨床志愿者的血液基因組DNA樣本進行基因突變的篩查。
　　結果：在一定的反應體系和反應條件下，突變檢測引物與野生模板不配對，無PCR產(chǎn)物，而與突變模板相配對，則有PCR產(chǎn)物。在優(yōu)化 PCR反應退火溫度的過程中，隨著退火溫度的升高，突變敏

4、感性分子開關的特異性提高。在不同的反應體系中，重組質粒經(jīng)定量后，稀釋成108、107、106、105、104、103、102、101拷貝/μL濃度梯度作為模板，然后再以稀釋的質粒分別作為模板，本課題所構建的突變敏感性分子開關檢測平臺對于A1555G、C1494T的檢測靈敏度達到103拷貝，特異性達到106拷貝，961delT的檢測靈敏度達到102拷貝，特異性達到105拷貝，在同一反應體系的多重引物延伸反應中，對三位點突變進行同時檢測，突

5、變重組質粒經(jīng)定量后，稀釋成108、107、106、105、104、103、102、101拷貝/μL濃度梯度作為模板，本課題所構建的突變敏感分子開關檢測平臺對于三位點同時檢測的靈敏度達到104拷貝。突變敏感性分子開關對50例臨床志愿者mtDNA12S rRNA基因 A1555G、C1494T、961delT突變的篩查均沒有發(fā)現(xiàn) A1555G、C1494T、961delT突變攜帶者。
　　結論：利用突變敏感性分子開關技術，建立了快速篩