胃腸道間質(zhì)瘤PDGFRA基因突變的惡性轉(zhuǎn)化及藥物敏感性研究.pdf

1、一、目的： 通過觀察胃腸道間質(zhì)瘤PDGFRA基因中一個(gè)新的突變位點(diǎn)L839P的對(duì)中國倉鼠卵巢上皮細(xì)胞(CHO)的增殖、凋亡、蛋白表達(dá)、裸鼠成瘤性及對(duì)伊馬替尼敏感性的影響作用,從而明確PDGFRA基因突變?cè)谖改c道間質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的惡性轉(zhuǎn)化作用以及其對(duì)腫瘤的伊馬替尼敏感性的影響。 二、方法： 1、收集25例胃腸道、腸系膜及網(wǎng)膜部位的GIST新鮮標(biāo)本,抽提基因組DNA,PCR擴(kuò)增后直接送測(cè)序檢測(cè)PDGFRA基因exon

2、12及exon18突變情況,以期發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)； 2、將所構(gòu)建的質(zhì)粒pcDNA3.1空載體(NP)、PDGFRA野生型(P)、PDGFRAL839P(M1)、PDGFRA D842V(M2)通過脂質(zhì)體法分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,用Western-blot法檢測(cè)PDGFRA蛋白的表達(dá)情況；通過細(xì)胞計(jì)數(shù)描繪細(xì)胞生長曲線,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期,Annexin V檢測(cè)細(xì)胞凋亡,從而明確PDGFRA點(diǎn)突變L839P對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響

3、作用： 3、將四株穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞分別注射于SPF動(dòng)物裸鼠背部皮下,飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中,以轉(zhuǎn)染空載體組及野生型質(zhì)粒組為對(duì)照,觀察轉(zhuǎn)染了PDGFRA突變型質(zhì)粒的CHO細(xì)胞的裸鼠成瘤性： 4、將PDGFRA突變型質(zhì)粒(M1、M2)與KIT野生型質(zhì)粒(W)分別共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,Western-blot法檢測(cè)KIT的蛋白表達(dá)及磷酸化情況,明確共轉(zhuǎn)時(shí)PDGFRA突變體對(duì)野生型KIT蛋白表達(dá)及磷酸化的影響； 5、將PDGFRA四

4、株穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞分別與不同濃度伊馬替尼共同孵育72小時(shí)后,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；將PDGFRA及KIT野生型及突變型質(zhì)粒KIT Ins IPYD579(S)與Del 559-560(Po)分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞24小時(shí)后,各自加入不同濃度伊馬替尼共同孵育90分鐘后抽提細(xì)胞蛋白,Western-blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)及磷酸化情況,從而了解該突變體對(duì)GIST的伊馬替尼敏感性的影響作用。 三、結(jié)果： 1、25例GIST中,檢測(cè)出

5、一例exonl8點(diǎn)突變Y849H,突變導(dǎo)致第849位酪氨酸被組氨酸所取代:exon12突變未檢測(cè)出。 2、四株穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞抽提蛋白Western-blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了PDGFRA野生型(陰性對(duì)照組)及突變型(實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組)的細(xì)胞均有PDGFRA蛋白表達(dá),突變型蛋白表達(dá)量有所增加；細(xì)胞生長曲線顯示實(shí)驗(yàn)組及陽性對(duì)照組較之陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組生長速度加快；細(xì)胞周期檢測(cè)顯示各組處于增殖期的細(xì)胞比例(S+G2-M)依次為：28.38

6、％(空白對(duì)照組)、24.47％(陰性對(duì)照組)、43.79％(實(shí)驗(yàn)組)、40.89％(陽性對(duì)照組);細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示四組的凋亡率分別為1.77％、1.90％、1.45％、1.57％。 3、陽性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞接種于裸鼠背部皮下,三周后可見腫瘤生長,鏡下顯示為上皮細(xì)胞樣的形態(tài)學(xué)特征。 4、PDGFRA突變型質(zhì)粒與KIT野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)CHO細(xì)胞后,磷酸化KIT蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)。 5、四株穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞與不同濃度伊馬替

7、尼共同孵育72小時(shí)后,加入高濃度伊馬替尼的實(shí)驗(yàn)組較之陽性對(duì)照組、空白對(duì)照與陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖明顯受抑；PDGFRA野生型(P)及突變型(M1、M2)質(zhì)粒、KIT野生型(W)及突變型(S、Po)質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)后與不同濃度伊馬替尼共同孵育90分鐘后,M1、S、Po磷酸化蛋白表達(dá)明顯受抑,P、M2與W變化不明顯。 四、結(jié)論： 1、本課題檢測(cè)出的一例PDGFRA外顯子18的點(diǎn)突變Y849H位于文獻(xiàn)報(bào)道的熱點(diǎn)位置,但突變的類型有所不同,

8、突變發(fā)生率為4％。該病例發(fā)生于胃,最大直徑為2.2cm,生物學(xué)行為表現(xiàn)為低度惡性。 2、通過檢測(cè)質(zhì)粒NP、P、M1、M2在CHO細(xì)胞的表達(dá),從而證實(shí)各重組質(zhì)粒已在CHO細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并表達(dá)。 3、與轉(zhuǎn)染空白載體及野生型PDGFRA cDNA組的CHO細(xì)胞系相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PDGFRA突變體的細(xì)胞生長速度明顯加快,增殖活性更強(qiáng),處于增殖期的細(xì)胞比例明顯較高,凋亡率減少,說明本例GIST中的PDGFRA突變?yōu)楣δ塬@得性突變。

9、 4、含有突變體重組質(zhì)粒的CHO細(xì)胞誘導(dǎo)裸鼠腫瘤生成獲得成功,說明本例PDGFRA基因突變對(duì)細(xì)胞有較強(qiáng)的惡性轉(zhuǎn)化作用,提示PDGFRA基因突變是導(dǎo)致GIST發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制之一。 5、PDGFRA基因突變可使野生型KFT蛋白激活,在無配體存在條件下出現(xiàn)自主磷酸化,提示PDGFRA基因突變引起腫瘤發(fā)生的機(jī)制除了使PDGFRA蛋白活化外,還可通過激活KIT蛋白引起下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制凋亡,導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。