HIV-1特定基因突變的耐藥性鑒定及其對(duì)病毒復(fù)制的影響.pdf

1、我國艾滋病免費(fèi)抗病毒治療開始于2003年，其覆蓋率到2011年9月底達(dá)到73.5％。隨著抗病毒治療時(shí)間的延長，HIV-1感染者中抗病毒治療失敗的情況不斷出現(xiàn)，耐藥性毒株成為治療失敗的主要原因。我國艾滋病的抗病毒治療具有鮮明的特點(diǎn)，一是我國流行的HIV-1毒株以CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC及B亞型為主，與歐美等國以B亞型為主的情況顯著不同;二是使用的抗病毒藥物為國產(chǎn)仿制藥;三是采取鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)療和疾控機(jī)構(gòu)統(tǒng)一發(fā)藥及管理病

2、人的治療模式。這些特點(diǎn)使得我國HIV-1毒株的耐藥性具有自己的特點(diǎn)和規(guī)律。我國已經(jīng)開展了HIV-1耐藥毒株的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，獲得了耐藥毒株的流行率、影響因素、對(duì)抗病毒治療的影響等一系列重要的數(shù)據(jù)。在抗病毒治療發(fā)展的過程中，不斷有突變被新鑒定為耐藥突變，新突變對(duì)HIV-1耐藥的影響、突變模式、突變之間的相互作用以及新突變對(duì)HIV-1毒株的復(fù)制能力的影響還沒有深入的研究。本課題首先對(duì)部分地區(qū)HIV-1感染者的基線耐藥和HIV-1抗病毒治療失敗

3、后的耐藥情況進(jìn)行了分子流行病學(xué)研究。隨后對(duì)與抗病毒治療相關(guān)的突變及突變組合構(gòu)建了質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后利用重組病毒對(duì)我國常用抗病毒治療藥物進(jìn)行了耐藥表型檢測(cè)，并使用合適的方法分析了單一位點(diǎn)的作用和不同位點(diǎn)之間可能存在的相互作用。最后對(duì)攜帶相關(guān)突變組合的病毒株的復(fù)制能力進(jìn)行了研究。
　　綜合全部研究結(jié)果，旨在掌握我國HIV-1耐藥毒株流行情況、闡明突變之間的相互作用及攜帶耐藥突變病毒的生物學(xué)特征，為臨床深入認(rèn)識(shí)HIV-1耐藥機(jī)理及耐藥病人的科

4、學(xué)管理提供理論依據(jù)、為確保我國抗病毒治療效果提供實(shí)際指導(dǎo)。
　　第一部分我國部分地區(qū)HIV-1基因型耐藥的橫斷面研究
　　目前，耐藥HIV-1毒株在我國各地廣泛出現(xiàn)和流行，掌握耐藥毒株流行狀況是臨床有效治療病人的基礎(chǔ)。本部分研究旨在了解我國HIV-1耐藥毒株的分子流行病學(xué)特征，為進(jìn)一步研究和臨床抗病毒治療提供指導(dǎo)。我們收集2009年全國范圍內(nèi)8個(gè)省市的304例從未接受抗病毒治療的艾滋病患者的血漿標(biāo)本和2010年河南和河北兩省

5、476例一線抗病毒治療失敗的艾滋病患者的血漿標(biāo)本，采用HIV-1基因型耐藥檢測(cè)方法進(jìn)行了基因型耐藥檢測(cè)，擴(kuò)增目的基因片段長2.0 kb，包含HIV-1蛋白酶的99個(gè)氨基酸和逆轉(zhuǎn)錄酶的560個(gè)氨基酸，計(jì)算耐藥毒株流行率并分析耐藥相關(guān)的因素。
　　結(jié)果:(1)2010年河南省和河北省抗病毒治療失敗標(biāo)本擴(kuò)增檢測(cè)成功321份，耐藥率高達(dá)67.6％，NRTIs和NNRTIs耐藥分別達(dá)到了54.21％(174/321)和65.42％(210/

6、321)。NRTIs耐藥突變主要是TMAs突變和M184V; NNRTIs耐藥突變中以K103N和Y181C最為常見，其次是G190A/S和H221Y。Y181C和H221Y聯(lián)合突變?cè)诤颖笔『秃幽鲜〉哪退帢?biāo)本中分別占到23.33％(7/30)和16.58％(31/187)，K103N/Y181C/H221Y在河北省和河南省耐藥標(biāo)本中分別占6.67％(2/30)和11.76％(22/187)。(2)未接受抗病毒治療的標(biāo)本擴(kuò)增檢測(cè)成功269

7、份，基線耐藥率為7.43％;深圳的基線耐藥為17.86％，顯著高于其他地區(qū)(x=4.9327，P=0.0264);B亞型的基線耐藥顯著高于非B亞型(P=0.0177);NNRTIs耐藥突變包括K103N、Y181C、V179D/E、G190E和K238N; PIs耐藥突變中包括能夠引起NFV高度耐藥的N88S、D30N和L90M。在這些標(biāo)本中，新報(bào)道的HIV-1流行重組毒株CRF5501B在2009年廣州和深圳的男男性行為人群中的流行率

8、為9.84％。
　　結(jié)論:受到樣本量和標(biāo)本保存的影響，部分地區(qū)的擴(kuò)增成功率較低，可能對(duì)結(jié)果有影響。本研究提供了部分地區(qū)抗病毒治療失敗耐藥和基線耐藥的概貌。河南和河北抗病毒治療失敗標(biāo)本中耐藥毒株的流行率非常高，嚴(yán)重地影響后續(xù)抗病毒治療效果。HIV-1基線耐藥的流行受到地區(qū)和病毒亞型的影響。近年來增長的男男性行為人群中HIV-1的亞型更為復(fù)雜。跟蹤基線耐藥病人的抗病毒治療效果有助于闡明基線耐藥對(duì)抗病毒治療的影響。
　　第二部分H

9、IV-1特定基因突變的耐藥性鑒定
　　HIV-1的耐藥突變十分復(fù)雜，截止到2008報(bào)道的突變已經(jīng)達(dá)到200多個(gè)，且不斷有新的耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)和鑒定。在藥物選擇壓力下，一些病毒基因的天然多態(tài)性位點(diǎn)很容易轉(zhuǎn)變?yōu)槟退幭嚓P(guān)突變位點(diǎn)。目前，主要耐藥突變位點(diǎn)的作用已經(jīng)清楚，但對(duì)很多新出現(xiàn)的和由多態(tài)性位點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)槎鴣淼耐蛔兊哪退幾饔眉捌渑c主要突變之間的相互作用尚不明確。我國流行的HIV-1毒株亞型、我國獨(dú)特的群體性治療模式使得耐藥突變的發(fā)生

10、和流行具有鮮明的特點(diǎn)。本研究的目的是闡明在我國接受抗病毒治療的艾滋病患者中廣泛流行的H221Y對(duì)耐藥的作用及其與其他突變的相互作用。我們從3名臨床耐藥的艾滋病患者血漿標(biāo)本中擴(kuò)增獲得含有不同耐藥突變組合(K103N/Y181 C/H221 Y/T215Y、V179E/Y181 C/H221 Y/T215Y、K101Q/Y181C/H221Y)的3段HIV-1 pol區(qū)基因，以HIV-1 pNL4-3為骨架構(gòu)建重組病毒。以此為基礎(chǔ)，對(duì)特定位

11、點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變或回復(fù)突變、轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞（Human embryonic kidney，HEK293T），收獲病毒，構(gòu)建含有不同突變組合的21株病毒，在MT2細(xì)胞上對(duì)病毒進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，測(cè)定感染性滴度(50％ tissue culture infectious dose，TCID50)，在TZM-bl細(xì)胞上測(cè)定這些病毒對(duì)4種抗HIV藥物的敏感性，以pNL4-3病毒上定點(diǎn)突變的3株病毒作為參比。每種藥物設(shè)11個(gè)濃度梯度、2復(fù)孔、重復(fù)3次，計(jì)

12、算50％抑制濃度（50％ inhibition concentration，IC50），采用析因設(shè)計(jì)的分析方法計(jì)算各個(gè)突變對(duì)耐藥的貢獻(xiàn)及突變之間的相互作用。
　　結(jié)果:(1) K103N/T215Y顯著提高EFV對(duì)病毒的IC50(88.98-fold)，V179E/T215Y、Y181C和K101Q分別使EFV對(duì)病毒的IC50提高18.46-fold、6.12-fold和6.76-fold，H221Y單一突變幾乎不影響EFV的IC

13、50值(1.41-fold)。分別使EFV的IC50提高88.98-fold和18.46-fold的K103N/T215Y和V179E/T215Y聯(lián)合突變均與H221Y無交互作用，而分別使EFV的IC50提高6.12-fold和6.76-fold的Y181C和K101Q均與H221Y有顯著交互作用(F=12.49，P=0.0028;F=28.10，P＜0.0001)。H221Y可拮抗K101Q對(duì)EFV的耐藥作用，使其相對(duì)于野生型的IC5

14、0由提高6.76-fold降低到二者相當(dāng)。(2) K103N/T215Y和V179E/T215Y均顯著提高AZT對(duì)病毒的IC50（30.66-fold，13.72-fold）。Y181C顯著的降低了AZT對(duì)病毒的IC50(0.335-fold)。H221Y對(duì)IC50的影響隨著基礎(chǔ)突變變化較大。分別使AZT的IC50提高30.66-fold和13.72-fold的K103N/T215Y和V179E/T215Y聯(lián)合突變均與H221Y無交互作

15、用，而分別使AZT的IC50改變0.335-fold和1.50-fold的Y181C和K101Q均與H221Y有顯著交互作用(F=18.71，P=0.0051; F=10.53，P=0.0011)。H221Y可拮抗Y181C對(duì)AZT的耐藥作用，使其相對(duì)于野生型的IC50由降低0.335-fold提高到二者相當(dāng)。(3) K101Q單一位點(diǎn)使3TC對(duì)病毒的IC50降低0.48-fold，K103N/T215Y、V179E/T215Y和Y18

16、1C對(duì)3TC的IC50幾乎沒有影響（1.35-fold、0.80-fold、1.29-fold）。H221Y對(duì)IC50的影響隨著基礎(chǔ)突變變化較大。H221Y可拮抗K101Q對(duì)3TC的耐藥作用，H221Y與V179E/T215Y有顯著的拮抗作用。K101Q、K103N/T215Y、V179E/T215Y和Y181C均不會(huì)使d4T的IC50顯著改變，H221Y單一位點(diǎn)顯著提高d4T對(duì)病毒的IC50(4.71-fold)。181和221之間不

17、存在交互作用(P=0.9708)。
　　結(jié)論:(1)我們首次采用析因分析設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法及分析檢驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)了221單一位點(diǎn)突變對(duì)耐藥的貢獻(xiàn)及與其他位點(diǎn)的交互作用。(2) H221Y單一位點(diǎn)對(duì)d4T的耐藥顯著提高，對(duì)EFV的耐藥提高較小，對(duì)AZT和3TC的作用隨著一起出現(xiàn)的突變位點(diǎn)而不同。(3) Y181C單一位點(diǎn)顯著提高AZT的敏感性。(4)基礎(chǔ)突變分別對(duì)EFV和AZT耐藥的影響顯著時(shí)，H221Y單一位點(diǎn)對(duì)耐藥的作用及與基礎(chǔ)位點(diǎn)之間的

18、交互作用不顯著。
　　第三部分?jǐn)y帶耐藥相關(guān)突變的HIV-1毒株的復(fù)制能力的研究
　　HIV-1耐藥突變可能使病毒的酶活性受損，導(dǎo)致復(fù)制能力下降，但病毒也可能發(fā)生補(bǔ)償突變，彌補(bǔ)復(fù)制能力的損失。本研究的目的是闡明攜帶常見耐藥突變的HIV-1毒株的復(fù)制能力。我們采用平行培養(yǎng)的方法，將第二部分研究中構(gòu)建的病毒等量接種MT2細(xì)胞，在沒有藥物壓力的條件下培養(yǎng)10天，定期取培養(yǎng)上清接種TZM-bl細(xì)胞，48小時(shí)(hour, h)后測(cè)定熒光

19、值，以野生型pNI4-3為參比，繪制病毒的復(fù)制動(dòng)力學(xué)曲線，用具有一個(gè)重復(fù)測(cè)量的兩因素定量資料的假設(shè)檢驗(yàn)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:(1) pNL4-3179/181/215復(fù)制能力在MT2細(xì)胞上最強(qiáng)，第三和四天分別提高71.69倍和132.94倍。(2)培養(yǎng)第五天后幾乎所有耐藥毒株的復(fù)制能力都高于野生毒株（2.21倍數(shù)-145.69倍）。(3)Y181C和H221Y突變均使pNL4-3179/215的復(fù)制能力在第6天和第7天顯

20、著的提高(P=0.0066，P＜0.0001，P=0.0363，P＜0.0001)，在pNL4-3103/215病毒攜帶的突變基礎(chǔ)上表現(xiàn)出相反的結(jié)果(P＜0.0001)。
　　結(jié)論:(1)首次發(fā)現(xiàn)攜帶突變V179E/Y181 C/T215Y、V179E/H221 Y/T215Y、V179E/T215Y、K103N/T215Y、K103N/Y181 C/T215Y的復(fù)制能力強(qiáng)于野生毒株。(2)復(fù)制能力的提高也可能是這些毒株耐藥的一個(gè)