腺病毒介導(dǎo)BTEB2反義RNA抑制大鼠頸動脈球囊損傷后新生內(nèi)膜增生的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的:經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)已成為目前治療冠心病的重要手段,但無論是經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)還是支架植入術(shù)都存在術(shù)后冠脈再狹窄(RS)的問題.RS的發(fā)生機制尚未完全明確,動物實驗及臨床研究資料表明,新生內(nèi)膜增生是各種PCI術(shù)后RS的共同特征.內(nèi)皮損傷后,在多種生長因子和細胞因子的作用下,中膜血管平滑肌細胞(VSMC)在短時間內(nèi)發(fā)生表型轉(zhuǎn)化和增殖(損傷后1天)并向內(nèi)膜遷移(4~7天),內(nèi)膜VSMC進一步增殖導(dǎo)致

2、新生內(nèi)膜形成及增生.因此,VSMC增殖是RS的主要病理機制的觀點目前已得到公認.基本轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合蛋白2(BTEB2)是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子,它與基因啟動子中GC序列結(jié)合,從而調(diào)節(jié)基因的表達.BTEB2在胚胎期動脈及內(nèi)皮損傷動脈中去分化的VSMC中高效表達,在成年動脈及正常VSMC中無表達.生長剌激(生長因子、佛波酯、AngII等)可誘導(dǎo)其在VSMC中大量表達.現(xiàn)有的文獻提示BTEB2可能在VSMC的增殖的過程中起重要作用,它可激活增殖相關(guān)基

3、因(PDGF、CDK4、TGF-β、c-jun),并參與VSMC表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控.因此,以BTEB2為目標的干預(yù)性研究可能為再狹窄防治開辟新的途徑.該研究擬通過腺病毒介導(dǎo)BTEB2反義RNA在培養(yǎng)VSMC中表達,抑制BTEB2蛋白表達,了解BTEB2反義RNA對體外培養(yǎng)VSMC增殖及其相關(guān)基因表達的影響;用反義BTEB2腺病毒載體轉(zhuǎn)染球囊損傷后的大鼠頸動脈,于在體水平探討B(tài)TEB2反義RNA對VSMC增殖及新生內(nèi)膜增生的影響.研究方法:采

4、用Ⅰ型膠原酶消化法進行大鼠主動脈VSMC原代培養(yǎng);從對數(shù)生長期的VSMC原代大鼠VSMC提取總RNA,用RT-PCR技術(shù)擴增得到BTEB2 cDNA片段;采用位置特異性重組方法構(gòu)建攜帶大鼠反義BTEB2基因的腺病毒載體Ad.ASBTEB2,通過293細胞擴增,純化制取高滴度重組腺病毒.Ad.ASBTEB2轉(zhuǎn)染培養(yǎng)VSMC后,用RT-PCR檢測BTEB2反義RNA的表達;以蛋白質(zhì)免疫印跡、免疫細胞化學(xué)及RT-PCR等技術(shù)檢測分析BTEB2

5、反義RNA對BTEB2、VSMC增殖相關(guān)基因(PCNA、AT1R、PDGF-BB)和表型標志基因(SMαA和Smemb)的蛋白及其mRNA表達的影響;用四唑鹽(MTT)比色試驗及流式細胞儀等方法檢測BTEB2反義RNA對血清誘導(dǎo)的VSMV增殖的影響.建立大鼠頸動脈球囊損傷模型,用Ad.ASBTEB2轉(zhuǎn)染球囊損傷后的大鼠頸動脈,1~3周后進行病理切片,檢測BTEB2反義RNA對新生內(nèi)膜增生的影響;采用免疫組化技術(shù)檢測BTEB2在新生內(nèi)膜中

6、的表達;用伊文氏藍染色檢測BTEB2反義RNA對損傷動脈內(nèi)皮修復(fù)的影響.研究結(jié)果:①用位置特異性重組技術(shù)成功構(gòu)建了攜帶攜帶大鼠反義BTEB2基因的腺病毒載體Ad.ASBTEB2,其滴度約5×1010pfu/ml;②在VSMC轉(zhuǎn)染重組腺病毒Ad.ASBTEB2后各時相點,經(jīng)RT-PCR均可檢測到BTEB2反義RNA的表達;③與未轉(zhuǎn)染組和Ad.LacZ組比較,Ad.ASBTEB2組各時相點的mRNA和蛋白表達明顯減少(p<0.01);④MT

7、T試驗顯示,在不同MOI組Ad.ASBTEB2組吸光度值均較未轉(zhuǎn)染組和Ad.LacZ組顯著降低(p<0.01),而且吸光度值降低的趨勢隨著MOI的增加而更加明顯;⑤通過流式細胞儀檢測VSMC增殖周期發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染Ad.ASBTEB2后可顯著增加G0/G1期細胞(p<0.01)及減少S期和G2/M期細胞比例(p<0.01).⑥免疫細胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染Ad.ASBTEB2可顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖相關(guān)基因PCNA、AT1R、PD

8、GF-BB的蛋白表達;⑦免疫細胞化學(xué)及RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),Ad.ASBTEB2轉(zhuǎn)染顯著抑制VSMC去分化型標志基因Smemb蛋白及mRNA表達(p<0.01),并逆轉(zhuǎn)血清誘導(dǎo)的分化型標志基因SMαA蛋白及mRNA的表達下調(diào)(p<0.01);⑧球囊損傷頸動脈內(nèi)膜被伊文氏藍染成明顯的深藍色,表明內(nèi)皮損傷效果明顯;損傷后1周新生內(nèi)膜開始形成,2周以后新生內(nèi)膜明顯向管腔內(nèi)增生造成明顯的管腔狹窄;⑨在正常動脈VSMC中,通過免疫組織化學(xué)檢測未見

9、到BTEB2的表達;未轉(zhuǎn)染組和Ad.LacZ組在球囊損傷后7和14天可檢測到明顯的BTEB2表達,損傷后21天BTEB2表達明顯減少;在各時相點Ad.ASBTEB2組BTEB2表達均顯著低于未轉(zhuǎn)染組和Ad.LacZ組(p<0.01);⑩重組腺病毒對損傷動脈中層VSMC的轉(zhuǎn)染效率約12﹪~30﹪;損傷后3周,與未轉(zhuǎn)染組和Ad.LacZ組相比,Ad.ASBTEB2組的I/M明顯降低(0.77±0.07 vs 1.63±0.36,1.81±0