根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)須癬毛癬菌ZafA基因的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、須癬毛癬菌是一種重要的人畜共患皮膚癬菌，主要感染人與動物的皮膚角質(zhì)層及其附屬角質(zhì)化組織。鋅是微生物重要的必需微量金屬元素之一，是細胞中的第二大過渡金屬，對病原微生物的生長、繁殖、致病力具有重要作用。目前已在多種真菌中發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控真菌細胞鋅離子穩(wěn)態(tài)的相關(guān)基因，其中鋅離子反應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活因子基因（ZafA）表達蛋白及其同源蛋白已被證明在病原性真菌胞內(nèi)鋅穩(wěn)態(tài)調(diào)控和致病力中具有重要作用。通過轉(zhuǎn)錄組測序已在須癬毛癬菌中發(fā)現(xiàn)ZafA基因，但該基因及其表

2、達的蛋白功能目前仍不清楚。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(ATMT)是目前真菌基因敲除的常用方法之一，已經(jīng)成功應(yīng)用于多種絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化。本文利用ATMT法對須癬毛癬菌ZafA基因進行遺傳轉(zhuǎn)化，構(gòu)建ZafA基因轉(zhuǎn)化株，并對須癬毛癬菌ATMT轉(zhuǎn)化體系進行優(yōu)化，為后續(xù)ZafA功能驗證奠定基礎(chǔ)。試驗結(jié)果如下:
　　1、將構(gòu)建完成的含有ZafA基因同源片段及潮霉素抗性標記基因的雙元載體pDHt/ZafA-ⅠⅡ∷hph轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中，PCR驗

3、證轉(zhuǎn)化成功后，利用帶有雙元載體的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化須癬毛癬菌分生孢子，PCR驗證結(jié)果證明須癬毛癬菌ZafA基因成功地被hph基因替代實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。
　　2、在轉(zhuǎn)化過程中使用不同的固相載體（Hybond N+尼龍膜、PVDF膜、濾紙），不同共培養(yǎng)時間(36h、48 h、60h)，預(yù)培養(yǎng)中是否加入AS，在28℃共培養(yǎng)條件下對轉(zhuǎn)化體系進行優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)預(yù)培養(yǎng)中加入AS獲得的轉(zhuǎn)化株數(shù)量顯著高于未加AS組，使用Hybond N+尼龍膜、濾紙均可獲得