根癌農桿菌介導BG2基因遺傳轉化花生的研究.pdf

1、花生是重要的油料兼經濟作物，真菌病害是花生的主要病害，導致其產量和品質嚴重下降。單純依靠常規(guī)育種方法很難選育出對真菌病害高抗的品種。而利用遺傳轉化將外源基因導入花生栽培種則應具有一定的可行性。本研究首先對花生組織培養(yǎng)植株再生方法進行研究，建立了胚小葉高效再生體系，然后利用遺傳轉化體系，通過農桿菌介導法，將β-1，3-葡聚糖酶基因轉入花生品種花育22，以提高花生抗病性。主要研究結果如下： 1.利用8個花生品種對花生組織培養(yǎng)進行研究

2、，結果表明：(1)基因型對再生率有很大影響，不同花生品種的愈傷組織形成和不定芽發(fā)生有明顯的差異。(2)花生外植體對花生組織培養(yǎng)的植株再生具有很大影響，胚小葉的芽誘導率明顯高于子葉、胚軸、胚根等其它外植體。(3)胚小葉的葉齡對不定芽誘導有很大影響，萌發(fā)5、6天的種子的胚小葉有利于誘導不定芽的形成，其中萌發(fā)6d的胚小葉最高，芽誘導率為91.3％。(4)以花生胚小葉作為外植體用于組織培養(yǎng)離體再生，具有取材簡單，來源豐富，再生率高的優(yōu)點，可將其

3、用于農桿菌介導的基因轉化。 (5)不同培養(yǎng)基對不定芽的伸長有很大影響，試驗發(fā)現(xiàn)，添加4mg/LBAP的培養(yǎng)基，芽伸長比較明顯，添加10mg/LBAP的培養(yǎng)基中芽叢生明顯。 2.確定了km的選擇壓，芽誘導培養(yǎng)基中添加km最低濃度為50mg/L可有效抑制非轉化愈傷組織的形成或芽再生。添加500mg/LCb可有效抑制農桿菌LBA4404的生長，且對花生外植體的再生無顯著影響。 3.對農桿菌介導遺傳轉化的適宜條件進行研究

4、，結果表明：(1)預培養(yǎng)3天的花生胚小葉外植體最適宜進行基因轉化。(2)菌液濃度對轉化率影響較大，以OD600=0.4為最好。(3)適宜侵染時間為10-15min，轉化率較高。(4)農桿菌共培養(yǎng)時間3d，轉化率較高。(5)種子萌發(fā)后6d的胚小葉為受體轉化效果最好。 4.將β-1，3-葡聚糖酶基因轉入花生栽培品種。利用優(yōu)化的遺傳轉化體系，以萌發(fā)6d的花生品種花育22的胚小葉為外植體，經農桿菌LBA4404侵染，Km篩選和標記基因P

5、CR檢測，得到目的基因轉化植株。 5.確立了農桿菌介導途徑進行花生遺傳轉化的技術規(guī)程：選用花生品種白沙1016或花育22的成熟飽滿的種子。經表面消毒后，接種于催芽培養(yǎng)基上，取萌發(fā)6d的胚小葉，接種于MSB5+6.0mg/LBAP+1.0mg/LNAA培養(yǎng)基上預培養(yǎng)3d。用活化的農桿菌重懸浮菌液(OD600=0.4)浸染10-15min，共培養(yǎng)3d，經700mg/LCb浸泡沖洗后，轉接到MSB5+6.0mg/LBAP+1.0mg/