須癬毛癬菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析及ZafA基因遺傳轉(zhuǎn)化用雙元載體的構(gòu)建.pdf

1、須癬毛癬菌（Trichophyton Mentagrophytes）是常見的人畜共患皮膚癬菌病病原，可引起嚴(yán)重的皮膚感染，但目前常用的真菌性皮膚病的防治手段相對(duì)簡單，對(duì)于該菌的研究仍大都停留在流行病學(xué)和藥物療效等方面，已不能滿足臨床醫(yī)學(xué)的需求。在真菌等微生物的生長和繁殖中，鋅是一種重要的微量營養(yǎng)元素，其常與多種功能蛋白結(jié)合以形成鋅指蛋白來完成生物學(xué)功能。目前，多種真菌的鋅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控因子已經(jīng)明確，如:煙曲霉的ZafA蛋白、酵母菌的Zap

2、1蛋白等，此類蛋白作為鋅響應(yīng)活力因子可在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)多種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而控制真菌對(duì)鋅離子的攝取，在真菌的生長和致病過程中扮演重要角色。但目前，須癬毛癬菌的鋅響應(yīng)活力因子的基因組成及功能還未確定，鋅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚，確定須癬毛癬菌中鋅響應(yīng)活力因子以及鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因組成對(duì)于須癬毛癬菌致病性的研究具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)多種真菌的鋅響應(yīng)活力因子的基因組成具有一定的相似性，初期試驗(yàn)，以煙曲霉鋅響應(yīng)活力因子的基因序列為基礎(chǔ)設(shè)

3、計(jì)引物，以須癬毛癬菌全基因組DNA、cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無法獲得須癬毛癬菌鋅響應(yīng)活力因子的基因組成。
　　因此，我們使用Illumina HiSeqTM2000技術(shù)對(duì)正常狀態(tài)下及鋅缺乏情況下的須癬毛癬菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了從頭組裝、基因功能注釋以及基因的差異表達(dá)分析等，后續(xù)通過BLASTX序列相似性搜索以及對(duì)須癬毛癬菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的分析確定出須癬毛癬菌鋅響應(yīng)活力因子的基因組成，初步推斷出

4、與鋅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的其他基因;并使用重組克隆技術(shù)構(gòu)建了針對(duì)ZafA基因的遺傳轉(zhuǎn)化用雙元載體，為后續(xù)的基因功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:
　　1使用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)須癬毛癬菌進(jìn)行了RNA-seq，共獲得10751個(gè)unigenes，89％以上的基因得到功能注釋，對(duì)于須癬毛癬菌的基因功能研究以及基因組圖譜的組裝提供了寶貴的數(shù)據(jù)支持。
　　2通過與煙曲霉ZafA基因、釀酒酵母Zap1基因進(jìn)行序列同源性比對(duì)以及功能注釋分

5、析等，確定了須癬毛癬菌中與鋅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因并高保真擴(kuò)增出須癬毛癬菌ZafA基因。
　　3將ZafA基因左右側(cè)翼片段以及來自質(zhì)粒pAN7-1的潮霉素B抗性基因（hph）同時(shí)插入到雙元載體pDHt/SK中，構(gòu)建ZafA基因轉(zhuǎn)化用雙元載體pDHt/ZafAⅠ、Ⅱ∷hph，經(jīng)PCR及酶切驗(yàn)證，雙元載體構(gòu)建成功。
　　試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究完成了須癬毛癬菌的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及功能注釋;確定了須癬毛癬菌ZafA基因的組成，并成功地構(gòu)建了轉(zhuǎn)化