四種支原體大鼠宮內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 本實(shí)驗(yàn)僅就肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，Mp)、發(fā)酵支原體(Mycoplasmafermentans，Mf)、梨支原體(Mycoplasmapirum，Mpi)、穿通支原體(Mycoplasmapenetrans，Mpe)宮內(nèi)感染導(dǎo)致各種不良妊娠結(jié)局予以探討，建立上述四種支原體宮內(nèi)感染動(dòng)物模型，從而為臨床實(shí)踐提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.培養(yǎng)基：制備改良SP4(用于Mpe、Mp

2、i、Mf和Mp的分離培養(yǎng))液體和固體培養(yǎng)基。 2.標(biāo)準(zhǔn)菌株來源：已知對(duì)照菌株Mpe(GTU-54-6A-1)、Mf(ATCC19989)、Mp(ATCCl5531)，Mpi(25960)均由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院流行病學(xué)教研室趙季文教授惠贈(zèng)。 3.菌液的制備：將保存于-20℃的凍干菌株接種于2ml改良SP-4培養(yǎng)基中，置于37℃，5％CO2孵箱中復(fù)蘇，待菌種至最佳生長期，取0.2ml菌液接種于1.8mlSP-4培養(yǎng)基中，以此方法

3、傳3代待支原體生長至對(duì)數(shù)期收集離心后的沉淀物，并每次進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，備用。 4.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：SD受孕大鼠，54只，體重180-230g/只，孕期12.5天，由溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。生理鹽水對(duì)照組11只；感染組共43只，其中Mpe、Mf和Mpi感染組各11只，Mp感染組10只。 5.模型的制備：大鼠受孕第12.5天開始感染，實(shí)驗(yàn)組用微量注射器吸取0.2ml對(duì)數(shù)生長期的支原體菌液(2×108-9CFU/ml)；生理鹽

4、水組取0.2ml生理鹽水，腹腔注射，連續(xù)注射3天。 6.母鼠及存活仔鼠觀察：注射支原體后，觀察孕鼠是否有流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎現(xiàn)象，各組間進(jìn)行比較；待胎兒鼠出生后，定期觀察其生長情況：觀測體重、有無畸形及出生后死亡等情況，各組間進(jìn)行比較，飼養(yǎng)1個(gè)月后解剖。 7.動(dòng)物感染后支原體再培養(yǎng)： 7.1母鼠血液、子宮角以及死胎仔鼠的心、肺均進(jìn)行支原體再分離培養(yǎng)。 7.2早產(chǎn)存活仔鼠生長至1個(gè)月在無菌環(huán)境下取每只母鼠的血液

5、、子宮角組織進(jìn)行培養(yǎng)：另每感染組選取9只早產(chǎn)仔鼠(要求其母鼠組織培養(yǎng)結(jié)果為陽性)，取血液及各臟器進(jìn)行培養(yǎng)；生理鹽水組隨機(jī)選取9只仔鼠取血液及各臟器進(jìn)行培養(yǎng)。 8.血清細(xì)胞因子比較：各組早產(chǎn)存活仔鼠心臟無菌采血分離血清，采用ELISA法檢測大鼠IL-10、TNF-α、IL-1β和IL-6，比較組間差異。 9.仔鼠各臟器電鏡標(biāo)本的制作與觀察：分別取各感染組培養(yǎng)結(jié)果為陽性的仔鼠腦、心、肝、肺經(jīng)2.5％戊二醛和1％鋨酸雙重固定，

6、丙酮梯度脫水，Epon-812環(huán)氧樹脂包埋，RMC-PT超薄切片機(jī)切片，半薄切片光鏡定位于待觀察的組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞部分，超薄切片經(jīng)鉛-鈾雙重染色，H-7500透射電鏡下觀察，拍片。 10.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和Fisher確切概率法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 結(jié)果： 1.再培養(yǎng)結(jié)果四種支原體感染組孕鼠以及仔鼠各自分離到相應(yīng)的支原體，生理鹽水組孕鼠子宮角和仔鼠血液及心、肺均未分離到上述支原體。

7、 2.四種支原體感染組流產(chǎn)、早產(chǎn)率為27.91％(12/43)。 3.四種支原體宮內(nèi)感染孕鼠死胎及圍產(chǎn)期死亡率為32.56％(14/43)。 4.四種支原體感染組早產(chǎn)仔鼠存活率為60.32％(76/126)；本實(shí)驗(yàn)觀察到的不良妊娠(包括自然流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎等)率為60.47％(26/43)，與生理鹽水組(0，0％)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 5.存活仔鼠生存狀態(tài)觀察感染組仔鼠與生理鹽水組比較

8、生長緩慢，體形瘦小，其中Mpi組有1只早產(chǎn)的仔鼠出現(xiàn)疑似腦癱的癥狀，肌張力明顯增高，生長緩慢，進(jìn)食困難，于生后14天死亡。 6.血清細(xì)胞因子比較感染組早產(chǎn)存活仔鼠血清中IL-1β，IL-6，TNF-α和IL-10較生理鹽水組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 7.電鏡觀察結(jié)果顯示仔鼠的心、肺、肝及腦組織內(nèi)感染有支原體，并顯示不同程度的炎癥和損傷。 結(jié)論： 1.四種支原體宮內(nèi)感染動(dòng)物模型的建立，