鹽酸13-己基小檗堿和鹽酸13-己基巴馬汀對NF-κB和p38MAPK信號通路的影響.pdf

1、炎癥相關性皮膚病在皮膚科發(fā)病率占據(jù)半數(shù)以上，以銀屑病、特應性皮炎等為代表。目前認為此類疾病是一種T淋巴細胞介導的免疫紊亂性皮膚病，與活化T淋巴細胞產生的Th1型細胞因子(以TNF-α、IFN—γ為代表)密切相關。T細胞和角質形成細胞分泌的細胞因子在炎癥性皮膚病中形成復雜的細胞因子網絡，導致其特有免疫病理損傷。核因子—kappa B(NF—κB)信號轉導通路和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號轉導通路異常與炎癥反應關系密切，成

2、為炎癥性皮膚病發(fā)病機制及藥物治療靶點的研究熱點之一。TNF-α和IFN—γ是皮膚炎癥反應中重要的病理因子，可引起角質形成細胞內蛋白激酶的連鎖反應，激活上述兩通路，參與調控炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展。 小檗堿系毛莨科黃連屬植物黃連的根狀莖中提取的主要有效成分，是傳統(tǒng)的抗菌藥物，有一定的抗炎等生物活性。鹽酸13—己基小檗堿(HB—13)是鹽酸小檗堿(BBR)的衍生物；巴馬汀(黃藤素)來源于黃藤等多種植物，鹽酸13—己基巴馬汀(HP—13)

3、是鹽酸巴馬汀的衍生物。HB—13和HP—13的結構非常類似。前期研究表明，兩個化合物具有原代化合物(小檗堿和巴馬汀)所不具備的、或強度超過原代化合物的生物活性，如抗菌、抗皰疹病毒和抗炎活性等。 本研究以HB—13和HP—13為研究的目標化合物，用來源于人正常皮膚的角質形成細胞永生化株HaCaT細胞作為研究體系，探討HB—13和HP—13對TNF-α和/或IFN—γ引起的HaCaT細胞NF—κB信號通路和p38MAPK信號通路活化

4、的影響，并研究了兩化合物對T淋巴細胞活化及對細胞因子表達功能的影響。 研究內容與結果分為三個方面： 第一章HB—13和HP—13對T淋巴細胞活化、對角質形成細胞IL—8表達及對小鼠腹腔巨噬細胞IL-1β表達的影響 通過體外培養(yǎng)小鼠脾細胞，用伴刀豆球蛋白A(ConA)作為刺激劑，用MTT法檢測HB—13和HP—13對小鼠T淋巴細胞活化的影響；通過rhTNF-α誘導HaCaT細胞，用ELISA測定HB—13和HP—1

5、3對rhTNF-α上調的細胞IL—8表達水平的影響；通過LPS刺激小鼠腹腔巨噬細胞，用ELISA檢測兩者對LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞IL-1β表達的影響。結果顯示，(1) HB—13在0.04875μg/ml～0.39μg/ml，HP—13在0.78μg/ml～3.12μg/ml濃度范圍內抑制小鼠T淋巴細胞增殖，抑制率分別為12.7％—78.2％和14.3％—92.5％，抑制作用具有劑量依賴趨勢，IC50值約為0.123μg/ml和1

6、.563μg/ml；(2)HB—13和HP—13在0.39μg/ml～3.12μg/ml實驗濃度范圍內能明顯降低經rhTNF-α上調的IL—8水平，IL—8表達抑制率約為85.7％—99.5％和68.4％—95.1％；(3)在0.01μg/ml～1μg/ml濃度范圍內，HB—13對LPS刺激的小鼠腹腔巨噬細胞IL-1β表達的抑制率超過50％，抑制作用有量—效趨勢，IC50值約為0.013μg/ml。1μg/ml HP—13能明顯抑制LP

7、S刺激的小鼠腹腔巨噬細胞IL-1β表達，抑制率超過90％。 以上結果表明，HB—13和HP—13對T淋巴細胞活化及炎癥性細胞因子IL—8和IL-1β表達有抑制作用。 第二章 HB—13和HP—13對人表皮角質形成細胞NF—κB信號轉導途徑的影響 通過體外培養(yǎng)HaCaT細胞、外源性rhTNF-α或rhIFN—，γ誘導細胞IκB-α蛋白磷酸化，利用免疫印跡法檢測HB—13和HP—13對TNF-α或IFN—γ誘導的Ha

8、CaT細胞NF—κB活化的影響。結果顯示，(1) HB—13和HP—13在0.39μg/ml～1.56μg/ml濃度范圍內抑制thTNF-α刺激引起的p—IκB-α表達，抑制率分別為47.4％—67.5％和32％—67.2％，抑制作用具有劑量依賴趨勢，IC50值約為0.441μg/ml和0.832μg/ml。(2)HB—13和HP—13對rhIFN—γ刺激引起的p—IκB-α表達也有抑制作用，在0.39μg/ml～1.56μg/ml濃度

9、范圍內抑制率分別為37.8％—57.4％和37.5％—43.6％，抑制作用也呈一定的劑量依賴趨勢，IC50值分別為0.923μg/ml和4.556μg/ml。 以上結果表明，HB—13和HP—13對rhTNF-α和rhIFN—γ引起的HaCaT角質形成細胞NF—κB活化均有抑制作用。 第三章 HB—13和HP—13對人表皮角質形成細胞p38MAPK信號轉導途徑的影響 通過體外培養(yǎng)HaCaT細胞，用外源性rhTNF

10、-α作為刺激劑誘導細胞p38MAPK蛋白磷酸化，利用免疫印跡法檢測HB—13和HP—13對TNF-α刺激的HaCaT細胞p38MAPK通路活化的影響。結果顯示，HB—13和HP—13在0.39μg/ml～1.56μg/ml實驗濃度范圍內對rhTNF-α刺激引起的p-P38的表達均無明顯抑制作用。 以上結果表明，HB—13和HP—13對rhTNF-α引起的HaCaT角質形成細胞p38MAPK途徑的活化無明顯抑制作用。兩化合物的抗炎