血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)小鼠胚胎心外膜祖細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化的實驗研究.pdf

1、目前,冠心病仍是世界上最常見的死亡原因,嚴(yán)重威脅人類的健康。研究冠狀動脈的發(fā)育,對于冠心病的防治以及人類的健康保障具有重要意義。心外膜祖細(xì)胞（epicardial progenitor cells;EpiCs）是最近提出的一組心臟祖細(xì)胞,起源于前體心外膜祖細(xì)胞,是一個表達(dá)Tbx18、 Wt1、Tcf21等多種標(biāo)記基因的祖細(xì)胞池。因其可分化形成血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、竇房結(jié)起搏細(xì)胞等多種心系細(xì)胞,對胚胎心臟的形成起重要作用,成為目前心

2、肌再生研究的一個焦點。目前已有大量研究證實心外膜祖細(xì)胞是冠狀動脈血管平滑肌細(xì)胞的主要來源之一,且參與該分化過程的機(jī)制眾多。血管緊張素Ⅱ(Angiontensin II;Ang II)作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中最重要的效應(yīng)分子,主要通過Ang II受體AT1、AT2起作用，除了本身固有的體液調(diào)節(jié)功能外,還是一個生長調(diào)節(jié)因子,與細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化及調(diào)亡均密切相關(guān)。除此之外,大量研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ可以誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

3、、等分化為平滑肌細(xì)胞。因此明確AngⅡ?qū)π耐饽ぷ婕?xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化的作用具有重要的臨床意義。
　　第一部分、心外膜祖細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　目的：
　　在體外成功培養(yǎng)C57BL/6小鼠E12.5d胚胎心外膜祖細(xì)胞，為體外研究心外膜祖細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞的分化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　分離小鼠E12.5d胚胎心臟組織進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)得到心外膜祖細(xì)胞，并通過細(xì)胞免疫熒光方法檢測EpiCs細(xì)胞特異性標(biāo)志

4、物Tbx18、Wt1的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　所培養(yǎng)的原代細(xì)胞高度表達(dá)Tbx18、Wt1，結(jié)合其來源和形態(tài)證實成功培養(yǎng)出心外膜祖細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　利用C57BL/6小鼠E12.5d胚胎心臟組織能成功培養(yǎng)出心外膜祖細(xì)胞。
　　第二部分、Ang II通過受體AT1誘導(dǎo)心外膜祖細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞的分化
　　目的：
　　探討Ang II誘導(dǎo)心外膜祖細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞的分化及相關(guān)通路。
　

5、　方法：
　　細(xì)胞免疫熒光檢測心外膜祖細(xì)胞表面AngⅡ作用受體AT1、AT2的表達(dá)。培養(yǎng)得到的原代心外膜祖細(xì)胞隨機(jī)分為AngⅡ組、AngⅡ+氯沙坦組、AngⅡ+PD123319組和對照組進(jìn)行干預(yù)。免疫熒光檢測血管平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物α-平滑肌肌動蛋白（alpha-sooth muscle actin，α-SMA)、肌球蛋白重鏈11（Myosin heavy chain11，Myh11）在各組的表達(dá)情況，實時熒光定量PCR檢測α-

6、SMA、Myh11在各組的mRNA表達(dá)水平,膠原凝膠收縮實驗分別檢測干預(yù)后細(xì)胞的收縮功能。
　　結(jié)果：
　　心外膜祖細(xì)胞膜表面有AngⅡ受體AT1、AT2的表達(dá)，給予AngⅡ干預(yù)7天后實驗組α-SMA、Myh11的表達(dá)明顯增多，其mRNA水平明顯高于對照組，經(jīng)AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞在卡巴膽堿的作用下也展示了明顯的收縮性。氯沙坦阻斷AngⅡ受體AT1后，AngⅡ干預(yù)使心外膜祖細(xì)胞的α-SMA、Myh11表達(dá)下降；PD123319阻