小鼠Tbx18+心外膜祖細胞向血管平滑肌細胞分化潛能的實驗研究.pdf

1、第一部分，Tbx18-Cre基因敲入小鼠Cre重組酶保真性研究
　　目的：揭示Tbx18-Cre基因敲入小鼠中Cre重組酶表達的保真性。
　　方法：利用實時熒光定量PCR法快速檢測不同基因型小鼠中Cre基因的相對拷貝數(shù)差異及Tbx18下游基因表達情況；運用Junction PCR及基因測序驗證Tbx18-Cre基因敲入小鼠中Tbx18-Cre整合位點的特異性；利用原位雜交，X-gal染色及EYFP熒光揭示Tbx18的譜系示蹤

2、及Tbx18+心外膜祖細胞的分化命運。
　　結(jié)果：不同基因型小鼠中Cre基因的相對拷貝數(shù)表達準確，Tbx18-Cre整合位點特異，Cre重組酶特異阻斷Tbx18轉(zhuǎn)錄表達導(dǎo)致其下游基因CX40及CX43表達量在Tbx18 Cre-Cre基因敲入小鼠模型中明顯高于野生型C57BL/6小鼠，Tbx18-Cre/Rosa26R-LacZ雙雜合小鼠中LacZ蛋白表達部位在胚胎發(fā)育早中期與運用Tbx18 cRNA進行原位雜交所顯示的雜交信號部

3、位一致，譜系示蹤揭示Tbx18+心外膜祖細胞可以遷移并分化形成部分心肌組織。
　　結(jié)論：Tbx18-Cre基因敲入小鼠中Cre重組酶的表達具有高度保真性及時空特異性，至今未發(fā)現(xiàn)Cre遺漏現(xiàn)象。
　　第二部分，小鼠Tbx18+心外膜祖細胞向血管平滑肌細胞分化潛能的研究
　　目的：揭示小鼠Tox18+心外膜祖細胞向血管平滑肌細胞分化的潛能。
　　方法：在體外培養(yǎng)細胞水平及體內(nèi)組織學(xué)水平利用Tox18-Cre/Rosa

4、26R-EYFP雙雜合示蹤小鼠模型對EYFP+細胞及組織進行譜系示蹤，并應(yīng)用血管平滑肌細胞標志物Myh11進行細胞及組織免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡觀察；應(yīng)用Ybx18-Cre/Rosa26R-LacZ雙雜合小鼠模型進行心臟組織X-gal染色后觀察LacZ蛋白表達細胞及組織形態(tài)。
　　結(jié)果：在細胞水平及組織水平EYFP+細胞及組織與Myh11共聚焦，X-gal染色陽性組織與心臟血管平滑肌結(jié)構(gòu)一致。
　　結(jié)論：Tbx18+心外膜