睪酮在巨噬細胞及其杜氏利什曼原蟲感染中的作用機制.pdf

1、雄激素可以促進多種疾病的發(fā)生發(fā)展,大量臨床及流行病學資料顯示,男性比女性更易感染細菌、病毒、寄生蟲等病原微生物,其具體機制不詳,可能與雄激素抑制機體免疫有關.黑熱病是由杜氏利什曼原蟲引起的一種致死性寄生蟲病,杜氏利什曼原蟲寄生于宿主的巨噬細胞中,從而引起一系列的單核巨噬細胞系統(tǒng)的病變.闡明雄激素在黑熱病中的作用機制將為疾病的預防和治療起重要的指導作用,我們在體外分離培養(yǎng)杜氏利什曼原蟲和骨髓巨噬細胞,試圖從分子水平探索雄激素對杜氏利什曼原

2、蟲細胞內感染的調控機理. 本實驗使用L929細胞條件培養(yǎng)基作為巨噬細胞集落刺激因子(macrophage-cloning stimulatory factor,M-CSF)來源,誘導小鼠骨髓細胞向巨噬細胞分化.原代培養(yǎng)5天后,利用熒光標記的巨噬細胞特異性F4/80抗體,通過流式細胞儀對培養(yǎng)體系中巨噬細胞的純度進行分析,同時分選出F4/80抗原呈陽性表達的細胞,此即為骨髓來源的巨噬細胞(bone marrow-derived ma

3、crophages,BMMs).首先用.Annexin V-FITC/PI雙染法觀察不同處理時間睪酮對巨噬細胞活性的影響.然后提取巨噬細胞的總蛋白,利用Western blotting方法分析睪酮處理組和杜氏利什曼原蟲感染組巨噬細胞中ERK1/2、p38MAPK和JNK/SAPK基因的激活狀況,并用特異性MAPK(有絲分裂原激活蛋白激酶)抑制劑進一步檢測MAPK信號途徑在杜氏利什曼原蟲感染巨噬細胞中的可能作用.為探討雄激素在巨噬細胞中的

4、作用機制,采用RT-PCR、Western blotting、FCM和CLSM等方法檢測巨噬細胞中是否有雄激素受體的表達,同時觀察不能自由透過細胞膜的testosterone-BSA(T-BSA)分子在巨噬細胞膜表面的結合狀況,最后測定巨噬細胞中游離鈣離子濃度. 實驗發(fā)現(xiàn),雄激素可以誘導骨髓巨噬細胞凋亡,并伴有Fas,FasL和Caspase-8凋亡相關基因的表達增加,我們推測雄激素是通過:Fas/FasL途徑誘導骨髓巨噬細胞凋

5、亡的.而感染了杜氏利什曼原蟲后的細胞凋亡數(shù)則明顯減少,凋亡在寄生蟲和宿主相互作用中具有重要意義,寄生蟲會因抑制宿主細胞發(fā)生凋亡而達到維持感染和蟲荷的目的. 性激素對靶細胞的作用可以通過兩種不同途徑來實現(xiàn):一種是經典途徑即基因組途徑,性激素通過自由擴散進入胞漿并與相應受體結合,活化的受體二聚體與HRE特異結合,啟動下游相關基因轉錄;另一種途徑是近幾年來逐漸引起人們關注的非基因組效應,其特點是作用快,不需進入細胞即可起效,隨后也可由

6、于細胞的內吞作用而進入胞內.本研究采用多種方法試圖在巨噬細胞中尋找雄激素的受體,包括RT-PCR、Western-blotting、FCM以及CLSM等,然而,這些方法都不能提供有說服力的證據(jù)說明巨噬細胞中存在雄激素的細胞內受體,很顯然,雄激素在巨噬細胞中的作用機理不能夠用傳統(tǒng)的激素.細胞內受體模式來解釋.相反,使用不能通過細胞膜的雄激素-BSA,我們發(fā)現(xiàn)巨噬細胞的表面存在有睪酮的結合位點,并且激素結合以后能迅速引起巨噬細胞內游離鈣離子

7、濃度增加,細胞內鈣離子的增加主要是由細胞外鈣離子內流而不是細胞內鈣離子釋放引起的. 我們發(fā)現(xiàn)雄激素可以增加杜氏利什曼原蟲對巨噬細胞的感染率與感染水平.寄生蟲對宿主細胞正常信號傳導途徑的干擾是其在胞內生存的必要條件,蛋白質的磷酸化和去磷酸化過程是生物體內普遍存在的信息傳導調節(jié)方式,幾乎涉及所有的生理及病理過程.MAPK是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,由于其性質的保守性和分布的廣泛性,在信號傳導過程中占有極其重要的地位.大量實

8、驗室證據(jù)表明,病原體感染可以干擾宿主細胞的MAPK信號途徑.在本實驗中,杜氏利什曼原蟲感染快速、可逆的激活了骨髓巨噬細胞的p38 MAPK信號分子,而對MAPK家族的ERK1/2和JNK/SAPK活性并沒有影響.我們進一步發(fā)現(xiàn),雄激素本身對MAPK信號分子的活性沒有影響,有趣的是,雄激素卻可以抑制杜氏利什曼原蟲對p38 MAPK的激活作用.使用p38 MAPK抑制劑SB203580可以抑制杜氏利什曼原蟲對p38 MAPK的激活作用,并進

9、一步發(fā)現(xiàn)SB203580亦可增加杜氏利什曼原蟲對巨噬細胞的感染率,說明p38MAPK信號途徑在杜氏利什曼原蟲感染杜氏利什曼原蟲中起重要作用. 睪酮可誘導胞內鈣離子增加,而鈣離子是一種重要的信號分子,可啟動一系列信號傳導途徑調節(jié)轉錄因子的活性,其在細胞內水平的高低影響許多細胞功能.我們預先用鈣鰲合劑BAPTA處理細胞,再加入睪酮和杜氏利什曼原蟲,發(fā)現(xiàn)在BAPTA處理組中,睪酮不能抑制杜氏利什曼原蟲p38 MAPK的激活作用,表明其

10、抑制作用是由鈣離子介導的. 根據(jù)非基因組效應的特點和骨髓巨噬細胞內未檢測到雄激素經典胞內受體的實驗結果,我們推測,雄激素增加了杜氏利什曼原蟲對巨噬細胞的感染,其啟動過程可能與雄激素膜受體途徑有關.雄激素通過膜受體途徑抑制了杜氏利什曼原蟲對宿主細胞p38 MAPK的激活作用,進而增加了原蟲的感染.膜受體途徑為我們進一步探討雄激素如何發(fā)揮其對免疫系統(tǒng)的抑制作用,雄激素與黑熱病間的關系,以及闡述類固醇激素的分子作用機理及其基因調控具有