杜氏利什曼原蟲NH36基因的克隆與表達.pdf

1、內(nèi)臟利什曼原蟲病(visceral leishmaniasis，VL)是一種重要的人獸共患寄生蟲病，其病原為杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)復合體。原蟲都屬于嘌呤營養(yǎng)缺陷型生物，只能依靠補救途徑合成嘌呤。核苷水解酶(Nucleoside hydrolases，NH)對原蟲核苷酸補救途徑具有關(guān)鍵作用。研究表明，NH在利什曼原蟲病診斷、疫苗免疫和作為哺乳動物利什曼病治療藥物成分等方面具有很好的應(yīng)用前景，但目前我國對利

2、什曼原蟲NH的研究尚屬空白。 重組蛋白疫苗以及核酸疫苗對于VL的免疫預防具有關(guān)鍵作用，L.donovani核苷水解酶36(L.d NH36)是其主要抗原復合體-巖藻糖-甘露糖配體復合體(fucose-mannose ligand，F(xiàn)ML)的主要免疫原性片段，因而，本研究建立了我國SC10H2株L.donovani的體外純培養(yǎng)，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴增并克隆L.d NH36編碼基因，經(jīng)鑒定及序列分析，構(gòu)建其原核重組表達載體pET-

3、28a-L.d-NH36，經(jīng)IPTG誘導表達，SDS-PAGE和Westem blotting鑒定，證明了L.d NH36重組蛋白得到了成功表達；制備并純化了L.dNH36重組蛋白，腹腔免疫BALB/c鼠，采用流式細胞儀對誘導產(chǎn)生的細胞免疫應(yīng)答進行檢測；最后構(gòu)建了L.d NH36真核重組表達質(zhì)粒pVAXl-L.d-NH36，脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染Hela細胞后對其表達情況進行鑒定。結(jié)果表明，獲得的NH36ORF為945 bp，編碼314個氨基酸

4、殘基，與國際標準株MHOM/KE/1975/MutingaH9比對，基因序列以及氨基酸序列同源性分別為88.78％和89.49％；表達蛋白為36KD，經(jīng)lmmoI/L IPTG誘導6 h后表達量最高，薄層掃描顯示表達的蛋白占菌體蛋白總量的57％，該蛋白可被抗L.donovani的多克隆抗血清識別；L.dNH36重組蛋白免疫后試驗組小鼠脾細胞流式細胞儀分析表明CD4<'+>T淋巴細胞進行了的增殖，可誘導機體產(chǎn)生一定水平的細胞免疫應(yīng)答；通過