人食管癌及癌旁間質(zhì)干樣細(xì)胞分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的：探討人食管癌間質(zhì)干樣細(xì)胞(mesenchymal stem-like cells from human esophageal carcinoma,hEC-MSCs)及癌旁間質(zhì)干樣細(xì)胞(mesenchymal stem-like cells from human esophageal carcinoma adjacent non-cancerous tissues,hECN-MSCs)體外分離培養(yǎng)方法,鑒定其生物學(xué)特性,并對(duì)兩者進(jìn)行

2、比較。
　　 方法：采用膠原酶消化法從25例人食管癌及癌旁組織中分離培養(yǎng)hEC-MSCs及hECN-MSCs,在含有15%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)、增殖并傳代;流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)記和細(xì)胞周期,繪制生長(zhǎng)曲線,檢測(cè)染色體核型,進(jìn)行形態(tài)學(xué)、細(xì)胞化學(xué)與分子遺傳學(xué)分析;提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)情況;成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)檢測(cè)其多向分化潛能;免疫組織化學(xué)技術(shù)從蛋白水平比較hEC-MSCs和hECN-M

3、SCs中a-SMA、CK18、Nanog及VEGF表達(dá)差異;細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和平板克隆實(shí)驗(yàn)比較hEC-MSCs和hECN-MSCs的條件培養(yǎng)液(conditioned medium,CM)對(duì)食管癌細(xì)胞系EC-1.17的生長(zhǎng)、增殖及遷移能力的影響。
　　 結(jié)果：膠原酶消化法分離的25例人食管癌及癌旁組織中,共分離培養(yǎng)出5例配對(duì)的hEC-MSCs和hECN-MSCs,所有實(shí)驗(yàn)均采用配對(duì)細(xì)胞進(jìn)行研究和比較。在形態(tài)上兩者均呈長(zhǎng)梭形

4、,NAP、POX染色均為陰性,PAS染色hECN-MSCs為陽(yáng)性,而hEC-MSC為弱陽(yáng)性;生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期檢測(cè)顯示hEC-MSCs增殖速率明顯高于hECN-MSCs;兩者均表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)基因Oct-4、Nanog、BMI-1及Nucleostemin及間質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因Vimentin、N.cadherin、TGF-β、Twist、a-SMA、Snail、VEGF和IGF-1,不表達(dá)上皮細(xì)胞相關(guān)基因E-cadherin;相比較hECN

5、-MSCs,hEC-MSCs高表達(dá)VEGF、BMI-1、Nanog和Oct-4;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明兩者均表達(dá)間質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)相關(guān)表面標(biāo)記CD13、CD29、CD44及CD105,不表達(dá)造血或內(nèi)皮細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)記CD45、CD133、CD34及HLA-DR;相比較hECN-MSCs,hEC-MSCs中CD105表達(dá)更強(qiáng);免疫組織化學(xué)分析顯示,和hECN-MSCs相比,CK18和VEGF在h

6、EC-MSCs中表達(dá)更強(qiáng),對(duì)于a-SMA,兩者表達(dá)強(qiáng)度相似,而Nanog在hEC-MSCs中呈弱表達(dá),在hECN-MSCs中不表達(dá)。hEC-MSCs和hEN-MSCs均含有46條染色體,核型正常,均具有分化為成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞的潛能。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和平板克隆實(shí)驗(yàn)表明,相對(duì)hECN-MSCs的CM(conditioned medium of hECN-MSCs,hECN-MSCs-CM)而言,hEC-MSCs的CM(conditi

7、oned medium of hEC-MSCs,hEC-MSCs-CM)具有更強(qiáng)地促進(jìn)食管癌細(xì)胞系EC-1.17生長(zhǎng)、增殖及遷移的能力。
　　 結(jié)論：采用膠原酶消化法能有效分離hEC-MSCs和hECN-MSCs,兩種細(xì)胞的生物學(xué)特性存在一定的差異;在細(xì)胞生長(zhǎng)速率、細(xì)胞周期及CM對(duì)EC-1.17細(xì)胞影響等方面差異較為明顯,其原因可能與構(gòu)成腫瘤基質(zhì)的hEC-MSCs能夠分泌某些細(xì)胞因子有關(guān),這些細(xì)胞因子也許與食管癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)