LncRNA CARLo-5對食管癌生物學特性的影響及其作用機制研究.pdf

1、第一部分：CARLo-5在食管癌組織和細胞中的表達及對其生物學特性的影響
　　目的：研究癌癥相關區(qū)域長鏈非編碼RNA CARLo-5在食管癌組織和細胞中的表達及對食管癌細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡和周期的影響。
　　方法：
　　1.應用 Realtime-PCR法檢測食管癌組織、癌旁組織以及食管癌細胞中LncRNA CARLo-5的表達。
　　2.應用MTS法、Transwell遷移、Matrigel侵襲和劃痕愈合

2、實驗檢測敲低/過表達CARLo-5基因對食管癌細胞增殖活性、侵襲和遷移能力的影響。
　　3.應用流式細胞術檢測CARLo-5對KYSE30和KYSE180細胞周期和早期凋亡的影響。
　　4.應用 MTS和流式細胞術檢測 CARLo-5在 KYSE30和 KYSE180細胞中對5氟尿嘧啶藥物敏感性的影響。
　　結果：
　　1.Realtime-PCR實驗結果顯示，與癌旁組織相比，食管癌組織中CARLo-5表達水平顯

3、著上調(diào)（P<0.05）；與正常食管上皮細胞相比，多種食管癌細胞中CARLo-5表達水平上調(diào)（P<0.05）。
　　2.MTS檢測結果顯示，敲低 CARLo-5基因可抑制 KYSE30和KYSE180細胞的增殖活性（P<0.05）；而過表達CARLo-5基因對KYSE30和KYSE180細胞的增殖具有促進作用（P<0.05）。Transwell和劃痕愈合實驗結果顯示，敲低 CARLo-5基因能抑制食管癌 KYSE30和 KYSE18

4、0細胞遷移和侵襲能力（P<0.05），過表達CARLo-5基因能夠促進KYSE30和KYSE180細胞的遷移和侵襲能力（P<0.05）。
　　3.流式細胞術檢測結果顯示，與對照組相比，敲低CARLo-5基因后KYSE30和KYSE180細胞的早期凋亡率增高（P<0.05）；G1期細胞比例均顯著增加（P<0.05），S期細胞比例均顯著降低（P<0.05）。
　　4.MTS分析結果顯示，敲低 CARLo-5基因可降低 KYSE3

5、0和KYSE180細胞對5氟尿嘧啶的藥物敏感性（P<0.05）；流式細胞術法檢測結果顯示，過表達CARLo-5基因可降低5氟尿嘧啶處理后的KYSE30和KYSE180細胞凋亡率（P<0.05）。
　　第二部分： CARLo-5對食管癌細胞作用機制研究
　　目的：研究CARLo-5與蛋白和microRNA相互作用的機制從而探討CARLo-5發(fā)揮的促癌作用的可能機制。
　　方法：
　　1.應用Western blot

6、法檢測敲低CARLo-5基因表達對食管癌KYSE30和KYSE180細胞周期、侵襲遷移、凋亡相關蛋白表達水平的影響。
　　2.應用RNA pulldown實驗、質(zhì)譜檢測、RIP實驗及Western blot實驗檢測CARLo-5能否與PTBP1結合。
　　3.應用 MTS法、Transwell遷移法檢測敲低 PTBP1基因，過表達CARLo-5基因同時敲低PTBP1基因對食管癌細胞增殖活性和遷移能力的影響。
　　4.應

7、用 Western blot法檢測食管癌細胞經(jīng)放線菌酮處理后，或經(jīng)Mg132聯(lián)合放線菌酮處理后，過表達CARLo-5基因對PTBP1蛋白表達水平的影響。
　　5.應用Western blot法檢測敲低PTBP1基因對KYSE30和KYSE180細胞凋亡相關蛋白和代謝相關蛋白表達水平的影響。
　　6.應用Realtime-PCR法檢測食管癌細胞中敲低和過表達CARLo-5基因后不同microRNA的表達變化，并篩選出差異顯著的

8、miR-218-5p進行后續(xù)研究。
　　7.應用MTS法、Transwell遷移、Matrigel侵襲和劃痕愈合實驗檢測敲低/過表達miR-218-5p對食管癌細胞增殖活性、侵襲和遷移能力的影響。
　　8.應用MTS法、Transwell遷移法檢測過表達CARLo-5基因同時敲低miR-218-5p對食管癌細胞增殖和遷移能力的影響。
　　9.應用Realtime-PCR法檢測食管癌細胞中敲低和過表達miR-218-5p

9、后靶基因的表達變化，并篩選出差異顯著的靶基因進行后續(xù)研究。
　　10.應用Western blot法檢測敲低和過表達miR-218-5p后對KYSE30和KYSE180細胞ROBO1、BMI1、RELN蛋白表達水平的影響。
　　結果：
　　1.Western blot實驗結果顯示，敲低 CARLo-5可誘導 KYSE30和KYSE180周期相關蛋白cyclinB1、cyclinD1、CDK2、CDK4表達水平降低，P2

10、1表達水平增高（P<0.05）；侵襲遷移相關蛋白 MMP9和 MMP2表達水平降低（P<0.05）；凋亡相關蛋白MCL-1表達水平降低（P<0.05）， Caspase-3表達水平增高（P<0.05）。
　　2.RNA pulldown、聯(lián)合質(zhì)譜分析、RIP和Western blot實驗結果顯示， CARLo-5在食管癌細胞中能夠與PTBP1蛋白相結合。
　　3.MTS法檢測結果顯示，與對照組相比，敲低 PTBP1基因可抑制

11、KYSE30和 KYSE180細胞增殖（P<0.05）；Transwell遷移結果顯示，敲低PTBP1基因可抑制KYSE30和KYSE180細胞遷移能力（P<0.05）。
　　4.MTS法檢測結果顯示，敲低PTBP1基因能夠降低CARLo-5過表達對KYSE30和KYSE180細胞增殖的增強作用（P<0.05）；Transwell遷移結果顯示，敲低 PTBP1基因能夠降低 CARLo-5過表達對 KYSE30和KYSE180細胞遷

12、移能力的增強作用（P<0.05）。
　　5.Western blot法分析結果顯示， KYSE30和KYSE180細胞經(jīng)放線菌酮處理后，與對照組相比，過表達CARLo-5可降低PTBP1降解程度（P<0.05）。
　　6.Western blot法分析結果顯示，KYSE30和KYSE180細胞經(jīng)MG132聯(lián)合放線菌酮處理后，與對照組相比，PTBP1蛋白表達水平無明顯差異。
　　7.Western blot實驗結果顯示，

13、敲低 PTBP1基因可促進 KYSE30和KYSE180細胞 PKM2蛋白水平降低， Mcl-1、PKM1蛋白水平升高（P<0.05）。
　　8.Realtime-PCR實驗結果顯示，敲低和過表達CARLo-5后KYSE30和KYSE180細胞中miR-218-5p表達水平分別增高和降低（P<0.05）。
　　9.MTS法檢測結果顯示，敲低 miR-218-5p可促進 KYSE30和KYSE180細胞增殖活性（P<0.05）

14、；而過表達miR-218-5p對KYSE30和KYSE180細胞增殖具有抑制作用（P<0.05）。Transwell和劃痕愈合實驗結果顯示，敲低miR-218-5p表達能促進KYSE30和KYSE180細胞遷移和侵襲能力，過表達miR-218-5p能抑制KYSE30和KYSE180細胞的遷移和侵襲能力（P<0.05）。
　　10.MTS法檢測結果顯示，敲低 miR-218-5p表達能夠部分降低CARLo-5過表達對KYSE30和K

15、YSE180細胞增殖的增強作用（P<0.05）；Transwell遷移結果顯示，敲低 miR-218-5p表達能夠部分降低 CARLo-5過表達對KYSE30和KYSE180細胞遷移能力的增強作用（P<0.05）。
　　11.Realtime-PCR實驗結果顯示，敲低 miR-218-5p和過表達miR-218-5p后KYSE30和KYSE180細胞中ROBO1、BMI1、RELN蛋白表達水平分別增高和降低（P<0.05）。

16、>　　12.Western blot實驗結果顯示，在 KYSE30和KYSE180細胞中敲低miR-218-5p和過表達miR-218-5p后可顯著影響ROBO1蛋白表達水平分別增高和降低（P<0.05），BMI1和RELN蛋白表達水平無明顯改變。
　　第三部分：CARLo-5對食管癌細胞裸鼠種植瘤的影響
　　目的：研究CARLo-5在體內(nèi)對食管癌增殖的影響。
　　方法：
　　1.構建穩(wěn)定敲低CARLo-5的食管

17、癌細胞，進行裸鼠皮下種植瘤實驗，并觀察種植瘤的生長情況。
　　2.應用免疫組織化學法檢測裸鼠種植瘤組織中PTBP1的表達情況。
　　結果：
　　1.與對照組相比，sh-CARLo-5組裸鼠皮下種植瘤增長速度顯著下降（P<0.05）。
　　2.免疫組織化學結果顯示，敲低 CARLo-5組的裸鼠種植瘤組織中PTBP1的表達水平明顯低于對照組。
　　結論：
　　食管癌組織和細胞中CARLo-5的表達水平上調(diào)