“雙固一通”針法對帕金森病模型大鼠中樞免疫調節(jié)作用的實驗研究.pdf

1、目的： 帕金森病(Parkinson's disease，PD)主要以中腦黑質內多巴胺能神經元進行性變性喪失為特征，是一種好發(fā)于中老年人常見的緩慢進展性神經系統(tǒng)變性疾病，發(fā)病率在神經變性疾病中處于第二位，而且發(fā)病率隨著年齡增長而逐漸增高，65歲以上的老年人中，發(fā)病率占到1％～3％。當紋狀體內多巴胺水平減少70％～80％，中腦黑質多巴胺能神經元變性超過50％時，與兒茶酚胺能神經遞質之間的功能失調，導致錐體外系運動功能障礙，如出現靜

2、止性震顫、強直、運動過緩和姿勢不穩(wěn)等表現。 研究顯示，幾乎所有的中樞神經系統(tǒng)變性疾病中小膠質細胞均有可能參與到發(fā)生、發(fā)展的各個階段，但在PD的發(fā)展中小膠質細胞的激活具有更加重要的意義。首先，氧自由基損傷在多巴胺能神經元損傷中具有決定意義，而小膠質細胞的激活是大量自由基產生的主要來源，其次，組織學研究表明中腦黑質區(qū)是小膠質細胞最富集的區(qū)域。在PD患者腦脊液中，伴隨著中腦黑質致密部DA能神經元選擇性喪失的是大量表達人類白細胞抗原(H

3、LA)的小膠質細胞的激活，DA能神經元的喪失程度與小膠質細胞激活呈平行關系。小膠質細胞激活后所釋放的前炎癥細胞因子和過量的自由基介導了DA能神經元的損傷，因此只要能抑制小膠質細胞激活，就能最大限度的減少DA能神經元的丟失。 近年來，傳統(tǒng)中醫(yī)藥療法治療PD的研究取得了一定的進展，尤其是針灸作為一種獨特、安全、方便的治療方法已經越來越多地運用于臨床，取得了較為肯定的療效。毫針、頭針、電針等常用的針灸法用于帕金森氏病的治療，針灸可以對

4、肌電位產生影響、調整抗氧化酶系統(tǒng)，提高腦內DA水平及對免疫因子成分產生影響。但有關針灸治療PD作用機制的深入研究甚少。我們在前期工作中，導師王華教授根據祖國醫(yī)學理論，認為肝風內動是本病的主要病機，主病在肝，病位在腦，確定了通調腦絡，熄風止顫，柔肝舒筋的治療原則，根據“雙固一通”針灸法的指導思想，選取關元、足三里、太沖、風府四穴，對PD模型大鼠施以電針治療，發(fā)現針刺可使PD大鼠中腦黑質TH活性增強，大腦皮質一氧化氮合酶(NOS)表達降低，

5、紋狀體谷氨酸(Glu)含量下降，膠質細胞系源性神經營養(yǎng)因子(GDNF)表達增強，并觀察了黑質神經元的超微病理改變。本課題擬在前期工作的基礎上，建立早中期PD大鼠模型，采用免疫學和分子生物學實驗方法，從細胞免疫、體液免疫、免疫調控等方面入手，在細胞和分子水平闡明針刺治療對PD免疫功能的調節(jié)作用，從而為揭示針刺治療PD的作用機制提供實驗依據，并為臨床治療提供指導作用。 方法： 1.建立早中期偏側PD大鼠模型：SD大鼠40只，

6、隨機分為4組：正常組，假手術組，模型組，“雙固一通”組。在腦立體定位儀上，將6-OH DA 15μg(溶于3μl含0.2％維生素C的生理鹽水中)，注入大鼠一側紋狀體尾殼核，術后第6周后以阿樸嗎啡(apomorphine，APO)腹腔注射(0.5mg/kg)誘發(fā)旋轉行為，40min內平均轉速超過7r/min者為造模成功。 2.“雙固一通”針刺治療方法：取關元、足三里、太沖、風府，28號1寸毫針針刺，接G6805A型電針治療儀，采用

7、斷續(xù)波，頻率為2Hz，每天1次，每次30分鐘，連續(xù)治療2周后取材。 3.“雙固一通”針法對PD模型大鼠黑質多巴胺能神經元含量的影響：以免疫組織化學方法檢測各組黑質酪氨酸羥化酶(TH)陽性細胞和纖維的形態(tài)及數量。 4.“雙固一通”針法對PD模型大鼠黑質小膠質細胞含量的影響：采用蓖麻凝集素標記小膠質細胞。 5.“雙固一通”針法對PD模型大鼠黑質TNF-α和IL-1β含量的影響：運用抗細胞因子單克隆抗體測定法測定TNF

8、-α含量，運用免疫組織化學染色法檢測IL-1β。 6.“雙固一通”針法對PD模型大鼠黑質補體C1q和C9水平的影響，采用采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測。 7.“雙固一通”針法對PD模型大鼠黑質神經元Bcl-2 mRNA表達的影響：rt-PCR方法檢測Bcl-2 mRNA基因表達。 結果： 1.模型組損毀側黑質致密部神經元總數、TH陽性神經元、神經纖維數量顯著低于正常組和假手術組(P<0.01)，“雙固一

9、通”組與模型組比較各相應指標數值顯著增加(P<0.01)； 2.正常組和假手術組幾乎未見陽性小膠質細胞，而雙固一通組的黑質小膠質細胞數量與模型組小膠質細胞數量相比降低(P<0.05)； 3.與模型組、正常組和假手術組相比較，“雙固一通”組大鼠黑質TNF-α和IL-1 β含量明顯降低(P<0.01)； 4.與模型組，正常組和假手術組相比較，“雙固一通”組大鼠黑質補體C1q和C9含量明顯降低(P<0.01.)；

10、 5與對照組相比，Bcl-2 mRNA在模型組的黑質內表達活性有所下降，“雙固一通”組Bcl-2 mRNA的表達增高，與模型組相比有顯著差異(P<0.05)。 結論： 1.“雙固一通”針法可以提高神經元總數、TH陽性神經元數量，阻止神經元進一步損傷； 2.“雙固一通”針法可以抑制PD大鼠黑質異常增多的陽性小膠質細胞數量； 3.PD大鼠TNF-α和IL-1β含量過高，“雙固一通”針法能降低二者含量，減少對