疫苗佐劑BCG-CpG-DNA的斑馬魚毒性評(píng)價(jià).pdf

1、本研究的佐劑BCG-CpG-DNA是中國(guó)食品藥品檢定研究院自主研發(fā)，其主要成分是含有少量的蛋白和多糖的核酸（分子量在3000至15710bp之間的雙鏈DNA），其中BCG-CpG-DNA濃度大約是多糖濃度的7倍，蛋白的150倍，并含有較多的非甲基化的CpG位點(diǎn)。由于CpG-DNA既有增強(qiáng)細(xì)胞免疫的刺激作用，又有增強(qiáng)體液免疫的刺激作用，在生物體內(nèi)主要激發(fā)Th1型免疫模式應(yīng)答，可作為新型人用疫苗免疫候選佐劑，但作為人用疫苗佐劑仍未應(yīng)用于臨床

2、。然而，在疫苗的研發(fā)和臨床實(shí)驗(yàn)中，對(duì)疫苗佐劑進(jìn)行安全評(píng)價(jià)是必不可少的。特別在對(duì)一種新型的免疫佐劑缺乏理化性質(zhì)、相關(guān)毒理學(xué)、相關(guān)免疫學(xué)研究和結(jié)論時(shí)，需要對(duì)疫苗佐劑開展一系列的臨床前研究和評(píng)價(jià)，研究和評(píng)價(jià)應(yīng)該涉及急毒實(shí)驗(yàn)、慢毒實(shí)驗(yàn)、單因子刺激和相關(guān)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)等。本實(shí)驗(yàn)旨在利用模式動(dòng)物斑馬魚初步評(píng)價(jià)CpG-DNA的毒性，為佐劑的安全性提供一些基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)支持;為CpG-DNA的應(yīng)用和推廣以及疫苗的研發(fā)提供理論依據(jù)，進(jìn)而為人類健康，抵御有害微生物

3、侵襲起到一定的積極作用。免疫佐劑的安全問題是一個(gè)非常關(guān)鍵的問題，在重視的同時(shí)又很容易被忽視。因?yàn)樽魟┍旧砭哂械拿庖邔W(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)，可能會(huì)對(duì)疫苗免疫反應(yīng)造成一定的困擾，甚至?xí)ぐl(fā)一些安全性問題。有鑒于此，必須對(duì)免疫佐劑進(jìn)行一系列的安全性研究和評(píng)估。
　　 本研究以斑馬魚作為模式生物，斑馬魚胚胎為實(shí)驗(yàn)材料，利用疫苗佐劑CpG設(shè)置0.15，1.5，15 and75 mg/L4個(gè)劑量組暴露斑馬魚，并以TMT作為陽(yáng)性對(duì)照，從胚胎期6 hp

4、f后開始暴毒實(shí)驗(yàn)，研究其對(duì)斑馬魚發(fā)育、遺傳、免疫以及行為毒性影響，每組做3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果顯示，CpG梯度劑量組與EM對(duì)照組無致死效應(yīng)，孵化率、存活率以及死亡率CpG梯度劑量組與EM對(duì)照組無顯著差異。TMT陽(yáng)性對(duì)照組在胚胎中主要致畸效應(yīng)為心胞腫大，TMT降低了斑馬魚胚胎的心率和孵化率，且對(duì)斑馬魚胚胎的自主運(yùn)動(dòng)、觸摸運(yùn)動(dòng)都有影響，CpG梯度劑量組與EM對(duì)照組無顯著差異，說明CpG無明顯的發(fā)育毒性。行為學(xué)研究中，光刺激測(cè)試結(jié)果顯示

5、，胚胎自6hpf染毒至96hpf,96hpf后脫毒的斑馬魚仔魚，第5天的光刺激刺激測(cè)試中，TMT組光暗交替時(shí)，魚體放映速度明顯上升，CpG梯度劑量組與EM對(duì)照組沒有顯著差異，結(jié)果說明TMT在斑馬魚胚胎中有發(fā)育和潛在的神經(jīng)毒性，CpG無顯著影響效應(yīng)但是也無保護(hù)作用。TMT刺激斑馬魚的免疫系統(tǒng)，激發(fā)起免疫反應(yīng)，其免疫熒光相對(duì)強(qiáng)度增強(qiáng)，CpG梯度劑量組與EM對(duì)照組無顯著差異，結(jié)果說明單一的CpG佐劑不具備激發(fā)免疫反應(yīng)的效應(yīng)。
　　 總

6、之，TMT低劑量暴露對(duì)斑馬魚生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫及其神經(jīng)等均有不同程度的影響，導(dǎo)致心胞腫大，對(duì)光暗刺激反應(yīng)敏感。CpG組未觀察到明顯的畸形和死亡情況，其自主運(yùn)動(dòng)、觸摸運(yùn)動(dòng)、行為檢測(cè)、免疫強(qiáng)度檢測(cè)與EM對(duì)照組均無明顯差別。結(jié)果表明，BCG-CpG-DNA暴露對(duì)斑馬魚生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫及其神經(jīng)均無明顯的毒性作用，在斑馬魚的胚胎暴露中具有較好的安全性。鑒于人類與魚類免疫機(jī)制差異性，不能單純地從魚類毒理實(shí)驗(yàn)直接推演至人類毒理機(jī)制。仍需進(jìn)一步深入BCG