米托蒽醌對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的急性毒性作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、抗腫瘤類藥物對(duì)水生脊椎動(dòng)物的發(fā)育毒性作用日益受到關(guān)注，米托蒽醌是一種典型的抗腫瘤類藥物，通過(guò)抑制DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。本研究以鹽酸米托蒽醌(Mitoxantrone hydorehloride，MA)為試驗(yàn)用藥，以斑馬魚(yú)胚胎為受試材料，檢測(cè)米托蒽醌對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育毒性和器官毒性作用，探究其毒性作用分子機(jī)制，為抗腫瘤類藥物的發(fā)育毒性評(píng)價(jià)和風(fēng)險(xiǎn)管理提供理論依據(jù)。
　　通過(guò)斑馬魚(yú)（AB品系）胚胎96h急性毒

2、性暴露實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MA對(duì)斑馬魚(yú)胚胎/幼魚(yú)具有致死效應(yīng)，其濃度-致死率曲線為典型的S型曲線;根據(jù)致死率方程，計(jì)算96 h半數(shù)致死濃度為880μg/L，表明MA在水體環(huán)境中屬于劇毒物質(zhì);MA的致死效應(yīng)主要發(fā)生在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育早期(24 hpf內(nèi))。
　　MA急性暴露對(duì)早期斑馬魚(yú)胚胎(＜48 hpf)具有致畸效應(yīng)。顯微成像結(jié)果表明，MA誘導(dǎo)斑馬魚(yú)胚胎軀干前段彎曲和尾部畸形，如尾部缺失、尾部組織萎縮;組織切片和HE染色實(shí)驗(yàn)表明，胚胎尾部組織

3、肌細(xì)胞排列松散，細(xì)胞邊緣模糊，細(xì)胞核擴(kuò)散，肌絲消失;在基因水平上，胚胎早期尾部發(fā)育相關(guān)基因marksa、marksb、supt5h和ta異常表達(dá)。MA急性暴露誘導(dǎo)P53凋亡通路基因apaf1、baxa、bcl2、casp3a和tp53基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，表明MA可能通過(guò)P53細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)斑馬魚(yú)胚胎尾部畸形。
　　MA急性暴露可引發(fā)斑馬魚(yú)胚胎的肝臟毒性。MA誘導(dǎo)72 hpf斑馬魚(yú)胚胎肝臟組織紊亂、結(jié)構(gòu)松散、空泡化和肝細(xì)胞腫脹等

4、病理現(xiàn)象。通過(guò)底物特異性酶活檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)72/96 hpf胚胎SOD和GST的酶活變化和MDA含量變化對(duì)MA表現(xiàn)出濃度依賴性，表明MA引起胚胎氧化應(yīng)激反應(yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化，可能是導(dǎo)致肝臟毒性的原因之一。
　　MA急性暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎產(chǎn)生神經(jīng)毒性。體視顯微鏡下統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)MA抑制24 hpf斑馬魚(yú)胚胎自主性抽搐;在基因水平上，100μg/L MA顯著抑制24 hpf胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)基因bdnf-v2、gap43、hand2、nkx2

5、.2a-v1、neurog、shha和syn2a的表達(dá)，其mRNA表達(dá)普遍下調(diào)2倍以上。MA急性暴露抑制24 hpf胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，特別是抑制神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育和突觸形成。
　　MA暴露導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡和神經(jīng)毒性由即刻早期基因介導(dǎo)。根據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)MA急性毒性暴露導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎DNA損傷，誘導(dǎo)即刻早期基因fos、jun和myc等基因上調(diào)表達(dá)，對(duì)靶基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞增殖和分化，干擾神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。jun基因編碼

6、產(chǎn)物還通過(guò)與DNA相互作用以及激活P53途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　非編碼RNA參與調(diào)控了MA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和神經(jīng)毒性作用。RNA-seq和生物信息學(xué)分析共篩選得到6456個(gè)lncRNA轉(zhuǎn)錄本，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)lncRNA的靶基因富集到細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、P53信號(hào)通路等KEGG通路，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡。篩選到32849個(gè)斑馬魚(yú)胚胎circRNA，在斑馬魚(yú)胚胎不同發(fā)育階段，MA誘導(dǎo)的差異表達(dá)circRNA的來(lái)源基因同時(shí)富集到神經(jīng)