SDF-1-CXCR4促進(jìn)骨髓來源細(xì)胞參與脈絡(luò)膜新生血管形成.pdf

1、研究背景：脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization,CNV）是年齡相關(guān)性黃斑變性(age related macular degeneration,AMD)導(dǎo)致嚴(yán)重視力喪失最主要的原因；其發(fā)病是一多因素參與的復(fù)雜過程，但確切機(jī)制仍未闡明。血管生成和血管發(fā)生是參與新生血管形成的兩種機(jī)制。一般來說，局部促血管生成因子參與血管生成，其主要細(xì)胞成份來源于已存在的毛細(xì)血管。然而，近年研究發(fā)現(xiàn)外周血骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)

2、胞（endothelial precursor cells,EPCs）可能參與病理性新生血管形成，包括視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜新生血管。作為CXC趨化蛋白超家族成員之一，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1,SDF-1）參與趨化骨髓來源細(xì)胞（bone marrow derived cells,BMCs）向靶組織募集，其受體CXCR4可表達(dá)于多種細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞及EPCs。
　　體內(nèi)、外研究證明，

3、SDF-1也是一種促血管生成因素。SDF-1或CXCR4基因缺陷小鼠中消化道大血管發(fā)育缺失。增殖性視網(wǎng)膜病變和CNV模型顯示，SDF-1/CXCR4可誘導(dǎo)EPCs聚集于新生血管形成部位，而CXCR4拮抗劑可明顯抑制包括缺血性視網(wǎng)膜新生血管和CNV在內(nèi)的多種眼內(nèi)新生血管病變。臨床研究表明，正常老年人及AMD患者脈絡(luò)膜中，視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）和脈絡(luò)膜損傷處SDF-1和CXCR4高表達(dá)

4、。
　　組織缺血時(shí)，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）可上調(diào)SDF-1表達(dá)，介導(dǎo)EPCs向缺血組織聚集，而CNV形成過程中也存在HIF-1α表達(dá)增加。RPE細(xì)胞可持續(xù)表達(dá)SDF-1，并在缺氧時(shí)表達(dá)增加。然而，SDF-1在CNV發(fā)生中的作用機(jī)制尚未完全闡明。
　　目的和內(nèi)容：探討SDF-1在CNV形成過程中的作用，進(jìn)一步闡明CNV的發(fā)生機(jī)制。在激光誘導(dǎo)的小鼠CNV模型中，

5、觀察HIF-1α和SDF-1表達(dá)；體外通過化學(xué)缺氧及運(yùn)用HIF-1小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）觀察SDF-1表達(dá)。觀察C57BL/6J-GFP嵌合體小鼠CNV模型中SDF-1誘導(dǎo)骨髓來源的EPCs和內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells,ECs）在CNV局部的聚集；體外模擬在不同SDF-1表達(dá)水平及微環(huán)境下新生血管生成情況，觀察SDF-1對(duì)BMCs分化的影響。
　　方法：1）利用53

6、2nm激光建立小鼠CNV模型，觀察CNV局部HIF-1α和SDF-1的表達(dá)；利用體外培養(yǎng)RPE細(xì)胞，觀察缺氧條件下，RPE細(xì)胞HIF-1α和SDF-1表達(dá)的情況；運(yùn)用siRNA技術(shù)構(gòu)建HIF-1α低表達(dá)的RPE細(xì)胞，觀察缺氧狀態(tài)下HIF-1α缺失對(duì)于RPE細(xì)胞SDF-1表達(dá)的影響；2）建立C57BL/6J-GFP嵌合體小鼠CNV模型，觀察CNV局部SDF-1表達(dá)及BMCs表面CXCR4、CD34、CD31和c-kit表達(dá)；3）體外培養(yǎng)人

7、原代BMCs和RF/6A細(xì)胞，通過三維共培養(yǎng)技術(shù)，比較不同SDF-1表達(dá)水平及不同微環(huán)境下，BMCs參與新生血管形成及發(fā)生分化的情況。
　　結(jié)果：免疫熒光染色顯示CNV部位HIF-1α表達(dá)升高，于24h達(dá)峰值；隨之SDF-1表達(dá)也升高，于3d達(dá)峰值，表達(dá)部位均位于近RPE層附近。缺氧誘導(dǎo)體外培養(yǎng)RPE細(xì)胞HIF-1α及SDF-1表達(dá)增高，于4小時(shí)達(dá)峰值；shHIF-1α抑制HIF-1α表達(dá)，同時(shí)SDF-1表達(dá)下調(diào)。脈絡(luò)膜鋪片及冰凍

8、切片間接免疫熒光染色結(jié)果表明，在CNV形成極早期，GFP陽(yáng)性的BMCs主要聚集于SDF-1高表達(dá)的光斑周圍的RPE層附近，形態(tài)較均一，其中包含大量EPCs細(xì)胞；CNV形成過程中，大量BMCs細(xì)胞進(jìn)入損傷內(nèi)部，部分細(xì)胞胞體變狹長(zhǎng)，分化為內(nèi)皮細(xì)胞（CD31+）形成管腔樣結(jié)構(gòu)，此時(shí)損傷周邊仍聚集大量的EPCs；隨CNV形成，可見大量新生血管管腔樣結(jié)構(gòu)交織成網(wǎng)，大量BMCs細(xì)胞分化的內(nèi)皮細(xì)胞胞參與其形成。CNV損傷局部聚集的BMCs均為CXCR

9、4陽(yáng)性，其中CD34陽(yáng)性和/或c-kit陽(yáng)性EPCs位于損傷周邊部，而同來源的CD31陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞隨CNV發(fā)展，漸伸入損傷核心區(qū)，參與新生血管形成。體外三維膠原纖維基質(zhì)模型顯示，SDF-1高表達(dá)組新生血管密集，單純SDF-1升高即可誘導(dǎo)BMCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，參與新生血管形成。
　　結(jié)論：在CNV形成過程中，缺氧誘導(dǎo)RPE層HIF-1α表達(dá)增高，上調(diào)SDF-1表達(dá)；SDF-1/CXCR4趨化BMCs聚集于CNV局部，并誘導(dǎo)部分BM