高血糖上調(diào)視網(wǎng)膜色素上皮細胞VEGF和SDF-1表達促進骨髓來源細胞參與糖尿病小鼠脈絡膜新生血管的血管發(fā)生.pdf

1、研究背景：脈絡膜新生血管（CNV）常導致視力的嚴重損害，乃至于視力喪失[1]。隨著人類平均壽命不斷增加和全球人口逐漸老齡化，繼發(fā)于年齡相關性黃斑變性（AMD）的CNV逐漸成為一個嚴重的醫(yī)學-社會問題[2]。CNV的形成包括血管生成和血管發(fā)生兩種形式：血管生成是指由已經(jīng)存在的微血管床產(chǎn)生新毛細血管的過程，而血管發(fā)生是指來自于循環(huán)中的骨髓來源細胞（BMCs）趨化并分化為血管細胞的過程[3,4]。骨髓來源的間充質(zhì)干細胞（BMSCs）是BMCs

2、的一個亞群，有研究表明其可特異性趨化至CNV處，并且可能作為治療CNV的載體細胞[5]。
　　大量遺傳因素和環(huán)境因素已被確認是新生血管性AMD的危險因素。糖尿病（DM）是一種常見的慢性疾病，其發(fā)病率和患病人數(shù)呈逐年上升的趨勢，已成為備受矚目的全球性公共健康問題[6]。最近有流行病學調(diào)查表明DM可能與新生血管性AMD相關，但是尚存爭議[7]。目前普遍認為在糖尿第四軍醫(yī)大學博士學位論文
　　病患者中BMCs和BMSCs的數(shù)量和功

3、能受到破壞，而糖尿病對BMCs和BMSCs參與CNV的血管發(fā)生尚無相關研究。
　　目的：探討高血糖對BMCs和BMSCs參與實驗性小鼠CNV血管發(fā)生的影響及可能機制。
　　方法：野生型 C57BL/6J小鼠隨機分為三組：正常對照組、糖尿病組（DM）和糖尿病+胰島素治療組（DM+INS）。DM組和DM+INS組小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（60 mg/kg/d）連續(xù)5d，繼續(xù)觀察7d后測血糖>16.7mol/l者納入后續(xù)實驗。DM+

4、INS組小鼠在確認成功建立糖尿病模型后開始給予皮下注射胰島素（10 U/kg/d），并監(jiān)測血糖。532nm倍頻激光光凝建立小鼠CNV模型。激光光凝后14d，眼底熒光血管造影、脈絡膜鋪片和HE染色衡量CNV的嚴重程度；激光光凝后3d，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和實時定量PCR（qRT-PCR）分別檢測小鼠眼球和RPE-脈絡膜-鞏膜復合體中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和基質(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1）的表達。
　　建立以綠色熒光蛋

5、白（GFP）轉(zhuǎn)基因小鼠為供體，野生型C57BL/6J小鼠為受體的嵌合體小鼠，流式細胞儀檢測嵌合體小鼠的嵌合度。嵌合體小鼠隨機分為正常對照組和DM組。激光光凝后3d脈絡膜鋪片和免疫熒光染色觀察綠色熒光細胞即BMCs趨化至CNV的情況，免疫熒光染色觀察CNV局部VEGF和SDF-1的表達；激光光凝后14d免疫熒光染色檢測CNV局部 BMCs表達血管內(nèi)皮細胞（CD31）、血管平滑肌細胞（α-SMA）和巨噬細胞（F4/80）標志物的情況。

6、>　　常規(guī)方法原代培養(yǎng) C57BL/6J小鼠 BMSCs，成脂和成骨誘導后分別以油紅O和茜素紅染色進行鑒定。以攜帶GFP報告基因的腺病毒轉(zhuǎn)染第3代小鼠BMSCs，24h后觀察轉(zhuǎn)染效率。C57BL/6J小鼠隨機分為正常對照組和DM組。在激光光凝后1～2h內(nèi)經(jīng)尾靜脈注射轉(zhuǎn)染GFP的BMSCs（2×106個/只），3d后脈絡膜鋪片觀察激光光凝處綠色熒光細胞即BMSCs趨化至CNV的情況。原代培養(yǎng)人BMSCs并鑒定，建立人BMSCs/視網(wǎng)膜色素

7、上皮細胞（RPE）共培養(yǎng)體系，分別觀察低糖組（D-，5.5 mmol/l葡萄糖）、高糖組（D+，25 mmol/l葡萄糖）和滲透壓對照組（M+，5.5 mmol/l葡萄糖+19.5 mmol/l甘露醇）條件下，人RPE細胞對BMSCs移行的影響。ELISA檢測共培養(yǎng)體系培養(yǎng)基中VEGF和SDF-1α的表達水平，qRT-PCR檢測RPE細胞中VEGF和SDF-1 mRNA的水平。
　　結(jié)果：DM組較正常對照組和DM+INS組 CNV

8、嚴重程度明顯增加，DM+INS組較 DM組 CNV嚴重程度明顯減輕但仍較正常對照組加重（p<0.05）；ELISA和qRT-PCR結(jié)果提示DM組較正常對照組和DM+INS組VEGF和SDF-1表達上調(diào)（p<0.05），DM+INS組VEGF和SDF-1表達較正常對照組上調(diào)，較DM組降低（p<0.05）。
　　嵌合度分析提示成功構(gòu)建嵌合體小鼠（嵌合度＞85％）。激光光凝3d后脈絡膜鋪片和免疫熒光染色結(jié)果提示DM組較正常對照組BMCs

9、面積、BMCs面積/CNV面積的比率、BMCs數(shù)量均明顯增加（p<0.05），且在CNV中VEGF和SDF-1蛋白表達升高（p<0.05）。激光光凝14d后CNV中BMCs表達CD31陽性和F4/80陽性細胞的比例增加（p<0.05），而α-SMA陽性細胞的比例無明顯改變（p>0.05）。
　　培養(yǎng)的小鼠 BMSCs呈貼壁生長，經(jīng)鑒定具有成脂和成骨多向分化潛能。腺病毒轉(zhuǎn)染24h后轉(zhuǎn)染效率約為70%。脈絡膜鋪片結(jié)果表明DM組較正常對