轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在香煙煙霧誘導(dǎo)粘蛋白MUC5AC表達(dá)中的作用.pdf

1、研究背景
　　 香煙煙霧中含有大量的氧化劑、自由基和有機(jī)物基團(tuán)，有些物質(zhì)可以長期沉積在肺組織小氣道中。香煙煙霧給肺組織帶來持續(xù)的氧化物刺激，造成明顯的氧化應(yīng)急。長期吸煙的患者氣道標(biāo)志性的改變包括氣道上皮杯狀細(xì)胞化生和增生，導(dǎo)致粘液分泌增多。
　　 氣道黏液是不同成分分泌物的混合物，根據(jù)其特性分為凝膠形成蛋白和膜相關(guān)黏蛋白兩大類。其中4種凝膠形成黏蛋白MUC2、MUC5AC、MUC5B及MUC19主要表達(dá)于氣道中，由氣道上

2、皮的杯狀細(xì)胞和粘膜下腺的粘液細(xì)胞分泌。氣道中的粘液能夠吸附一些顆粒和病原菌，以便通過纖毛上皮的纖毛運(yùn)動(dòng)予以清除。氣道上皮細(xì)胞MUC5AC及MUC5B的分泌過度是引起支氣管炎咳嗽咳痰癥狀的原因。無論是人類還是動(dòng)物模型中，氣道疾病如囊性肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等如合并氣道粘液過度分泌往往使得發(fā)病率和病死率進(jìn)一步惡化。
　　 紅細(xì)胞系統(tǒng)核因子相關(guān)因子2(nuclearfactorerythroid2relatedfactor2

3、，Nrf2)是CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員中活力最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，廣泛表達(dá)于如肝臟、腎臟、肺等多種組織。Nrf2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)是一種主要的細(xì)胞防御機(jī)制。Nrf2缺失或激活障礙，可加重氧化應(yīng)激源的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙、凋亡甚至死亡。
　　 目前尚無Nrf2在香煙煙霧誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)中作用的研究報(bào)導(dǎo)，我們希望通過本研究明確Nrf2在香煙煙霧誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)和氣道炎癥中的作用，并通過這一研究找到香煙相關(guān)的氣道炎癥、粘液分泌

4、過度的新的治療靶點(diǎn)。
　　 研究內(nèi)容
　　 第一部分香煙煙霧溶液誘導(dǎo)A549細(xì)胞粘蛋白MUC5AC及核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達(dá)
　　 目的：1、制備穩(wěn)定的香煙煙霧溶液；2、通過MTT法檢測香煙煙霧溶液對(duì)A549細(xì)胞的毒性，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要的合適煙霧溶液濃度；3、通過煙霧溶液刺激A549細(xì)胞并檢測Nrf2和MUC5AC的mRAN和蛋白表達(dá)，為后續(xù)研究確定合適的煙霧干預(yù)時(shí)間和濃度。
　　 方法：1、制備香煙煙霧

5、溶液，以分光光度儀測定OD320,檢測穩(wěn)定性；2、通過MTT方法檢測香煙煙霧溶液對(duì)A549細(xì)胞的毒性；3、不同時(shí)間香煙煙霧孵育A549細(xì)胞后以Q-PCR和WB方法分別檢測Nrf2和MUC5AC的mRAN和蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：1、連續(xù)14天制備的香煙煙霧溶液OD320平均為0.7394，標(biāo)準(zhǔn)差0.05804，95％可信區(qū)間為0.7213-0.7575，單因素方差分析提示數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，提示該方法得到的數(shù)據(jù)一

6、致性很好，該方法穩(wěn)定。2、通過MTT法提示香煙煙霧溶液隨著濃度的增高孵育時(shí)間延長，對(duì)A549細(xì)胞的抑制率增大。10%及以下濃度抑制率明顯小于25%以上濃度。10%濃度煙霧溶液在48小時(shí)抑制率明顯增高，孵育時(shí)間小24小時(shí)各時(shí)間點(diǎn)抑制率差別不明顯。3、10%煙霧溶液孵育A549細(xì)胞可以促進(jìn)Nrf2和MUC5AC的mRAN和蛋白表達(dá)，表達(dá)量隨著時(shí)間的延長而增加，至24小時(shí)可以達(dá)到最高。
　　 小結(jié)：1、本研究采用的香煙煙霧溶液方法得到

7、的結(jié)果穩(wěn)定，該溶液對(duì)人肺上皮樣細(xì)胞A549體外有細(xì)胞毒作用，呈時(shí)間和濃度依賴性。2、香煙煙霧溶液可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞粘蛋白MUC5AC的表達(dá)，這一作用在24小時(shí)內(nèi)呈時(shí)間依賴性。3、香煙煙霧溶液可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達(dá)。
　　 第二部分核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在香煙煙霧溶液誘導(dǎo)A549細(xì)胞粘蛋白MUC5AC表達(dá)中的作用
　　 目的：1、驗(yàn)證抑制A549細(xì)胞Nrf2基因表達(dá)可以增加香煙煙霧誘導(dǎo)MUC5AC的作用

8、；2、驗(yàn)證過表達(dá)A549細(xì)胞Nrf2基因表達(dá)可以減弱香煙煙霧誘導(dǎo)MUC5AC的作用；3、乙酰半胱氨酸對(duì)香煙煙霧誘導(dǎo)MUC5AC的作用有保護(hù)作用。
　　 方法：1、以小干擾RNA抑制A549細(xì)胞Nrf2基因基礎(chǔ)上，再以香煙煙霧溶液孵育A549細(xì)胞后分別以Q-PCR和WB方法檢測Nrf2和MUC5AC的mRNA和蛋白表達(dá)；2、以pCDNA3-Myc3-Nrf2質(zhì)粒過表達(dá)A549細(xì)胞Nrf2基因基礎(chǔ)上，再以香煙煙霧溶液孵育A549細(xì)胞

9、后分別以Q-PCR和WB方法檢測Nrf2和MUC5AC的mRAN和蛋白表達(dá)；3、以乙酰半胱氨酸干預(yù)煙霧溶液對(duì)A549細(xì)胞的作用后，以Q-PCR方法分別檢測Nrf2和MUC5AC的mRAN表達(dá)。
　　 結(jié)果：1、小干擾RNA有效抑制Nrf2的表達(dá)，陰性對(duì)照小于擾RNA組CSE刺激后MUC5AC蛋白表達(dá)增加64.33%，干擾組CSE刺激后MUC5AC蛋白表達(dá)增加195.33%，是前者的三倍多，兩者的差別有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

10、01)。2、pCDNA3-Myc3-Nrf2質(zhì)?？梢杂行Т龠M(jìn)Nrf2的表達(dá)，給予空質(zhì)粒對(duì)照組煙霧誘導(dǎo)MUC5AC蛋白增高約47.44%，pCDNA3-Myc3-Nrf2過表達(dá)后，煙霧誘致MUC5AC蛋白增高約25.74%，過表達(dá)Nrf2可以使煙霧誘導(dǎo)MUC5AC蛋白的量下降45.73%，兩者的差別有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。3、20mMNAC可以促進(jìn)Nrf2mRNA表達(dá)，減弱煙霧溶液誘導(dǎo)A549細(xì)胞MUC5ACmRNA的表達(dá)。<

11、br>　　 小結(jié)：1、在以siRNA有效敲除A549細(xì)胞Nrf2基因后，香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC較未敲除前增加程度增加。2、在以pCDNA3-myc3-Nrf2質(zhì)粒過表達(dá)A549細(xì)胞Nrf2基因后，香煙煙霧誘導(dǎo)的MUC5AC較未敲除前增加明顯減少。3、N-乙酰半胱氨酸體外可以促進(jìn)Nrf2基因表達(dá)，并可以減少香煙煙霧誘導(dǎo)MUC5AC的作用。
　　 第三部分核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在香煙煙霧誘導(dǎo)小鼠氣道炎癥及肺組織粘蛋白MUC5AC表

12、達(dá)中的作用
　　 目的：1、驗(yàn)證Nrf2在香煙煙霧誘導(dǎo)小鼠氣道炎癥中的保護(hù)性作用。2、驗(yàn)證Nrf2在香煙煙霧誘導(dǎo)小鼠粘蛋白MUC5AC表達(dá)中的保護(hù)性作用
　　 方法：1、分別給予正常ICR小鼠和Nrf2-/-ICR小鼠不同時(shí)間的短期(3、7和14天)熏煙后，通過無創(chuàng)氣道反應(yīng)性測定、支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺組織病理切片炎癥評(píng)分等方法明確香煙煙霧誘導(dǎo)的氣道炎癥及Nrf2在其中所起的作用。2、分別給予正常ICR小鼠和Nrf

13、2-/-ICR小鼠不同時(shí)間的短期(3、7和14天)熏煙后，通過肺組織病理切片PAS染色、通過WB測定肺組織蛋白中Nrf2蛋白的含量以及通過ELISA的方法檢測支氣管肺泡灌洗液中MUC5AC蛋白含量來比較各組粘液及粘蛋白MUC5AC表達(dá)情況及與Nrf2的關(guān)系。
　　 結(jié)果：1、短期熏煙后，正常ICR小鼠氣道反應(yīng)性均會(huì)增高，BLAF種細(xì)胞總數(shù)增加，中性粒細(xì)胞比例略增高，肺組織病理切片中炎癥評(píng)分會(huì)升高，熏煙時(shí)間延長，以上改變更明顯；敲

14、除Nrf2后，以上現(xiàn)象變得更加明顯。2、短期熏煙后，Nrf2-/-小鼠肺組織病理切片PAS評(píng)分明顯高于相同時(shí)間熏煙的正常ICR組，BALF中MUC5AC蛋白含量隨薰煙時(shí)間延長明顯增高。
　　 小結(jié)：1、短期香煙煙霧作用可以使Nrf2-/-小鼠表現(xiàn)為更明顯的中性粒細(xì)胞為主的氣道炎癥及氣道反應(yīng)性明顯增高。2、短期香煙煙霧作用可以使小鼠肺部粘蛋白MUC5AC表達(dá)增加，Nrf2-/-小鼠表現(xiàn)更加明顯。
　　 結(jié)論