靶向治療藥物對骨髓瘤細胞未折疊蛋白反應影響的實驗研究.pdf

1、目的和意義:多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是血液系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,雖然迄今為止仍然難以治愈,但是近年來出現(xiàn)的一些新的靶向治療藥物在部分MM尤其是對常規(guī)化療藥物耐藥的患者中取得了令人滿意的療效。其中蛋白酶體抑制劑(PI)硼替佐米由于其對骨髓瘤細胞的高度特異性殺傷性及其相對較輕的副作用已經(jīng)廣泛地應用于臨床,并且也顯示了可喜的療效。眾所周知,硼替佐米通過特異性地抑制26S蛋白酶體對IκB的降解,進而阻斷了NF-κB的

2、激活而發(fā)揮抗骨髓瘤活性。但這是否能完全解釋PI高度選擇性的抗骨髓瘤活性呢? 先前有學者報道蛋白酶體抑制劑(硼替佐米)與直接抑制NF-κB的藥物(包括特異性IκB激酶抑制劑PS-1145或不可逆的IκBα磷酸化抑制劑BAY11-7082)相比,具有更顯著的抗骨髓瘤細胞增殖的能力。這提示我們蛋白酶體抑制劑選擇性的抗骨髓瘤增殖效應不單純是抑制NF-κB的結(jié)果,其中一定還有其它的機制在發(fā)揮作用。 MM細胞與正常的漿細胞一樣,產(chǎn)生大量的需

3、要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)處理的分泌性免疫球蛋白,這些免疫球蛋白的合成過程中必然伴隨著錯誤折疊蛋白的出現(xiàn),包括有缺陷的核糖體產(chǎn)物等需要泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的降解。如果蛋白酶體的功能受到抑制必然影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的降解(ERAD),影響了錯誤折疊蛋白由ER腔向胞質(zhì)的逆向轉(zhuǎn)運(retrograde translocation),造成錯誤折疊蛋白在ER腔的累積引發(fā)ER應激(ERS)并激活未折疊蛋白反應(UPR),而持續(xù)或過度UPR,就可以導致細胞的凋亡。因此

4、MM細胞必定對于PI引發(fā)的ERAD受阻異常敏感。先前也有報道聯(lián)合應用PI與增加ER壓力的藥物如衣霉素(Tunicamycin)具有明顯的協(xié)同作用,可顯著增強對骨髓瘤細胞的殺傷效應,這也從側(cè)面提示PI對骨髓瘤細胞的殺傷效應可能與UPR密切相關(guān)。但是蛋白酶體抑制劑究竟是如何影響MM細胞中的UPR還需要進一步深入的研究。 另外一個靶向治療藥物2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME2)為雌二醇的生理代謝產(chǎn)物,具有

5、抗多種腫瘤的活性,目前已應用于臨床Ⅱ期試驗中。我們先前實驗研究發(fā)現(xiàn)低劑量2ME2(0.1μmol/L-0.5μmol/L)可誘導骨髓瘤細胞向成熟階段分化,表現(xiàn)為細胞向成熟漿細胞形態(tài)的轉(zhuǎn)變,細胞表面分化抗原CD49e的表達上調(diào),分泌的免疫球蛋白也增多。已有研究證實UPR在B細胞向漿細胞分化過程當中發(fā)揮著重要作用,保證只有正確折疊的抗體才能由漿細胞內(nèi)分泌出來。轉(zhuǎn)錄因子XBP-1通過UPR途徑介導B細胞向漿細胞分化。我們發(fā)現(xiàn)2ME2誘導骨髓瘤

6、細胞分化的過程中,XBP-l的確是上調(diào)的,并且是由其上游調(diào)控基因PRDM1的上調(diào)解除了轉(zhuǎn)錄因子PaX-5對XBP-1的抑制實現(xiàn)的,提示PRDM1--漿細胞分化階段的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在UPR中也發(fā)揮著重要作用。最近學者Doody等也提出PRDM1也是UPR的靶基因之一,B細胞中UPR激活后PRDM1mRNA表達水平迅速上調(diào)。 PRDM1為PRDM基因家族成員,該家族在腫瘤發(fā)生中存在著特殊的陰陽作用機制,即包含或缺失PR結(jié)構(gòu)域的兩種

7、同源異構(gòu)體分別發(fā)揮抑癌基因和癌基因的作用。那么在2ME2誘導骨髓瘤細胞分化的過程中對PRDM1兩種同源異構(gòu)體(包含PR結(jié)構(gòu)域的PRDM1α和缺失PR結(jié)構(gòu)域的PRDMI1β)表達的影響如何及其是否能夠與陰陽作用機制相吻合就需要進一步研究。 研究方法和結(jié)果： 一、以三個MM細胞系KM3、RPMI-8226和NCI-H929作為研究對象,首先采用MTT法檢測BZ作用后的細胞活力,計算各個細胞系的IC50濃度。然后分別采用熒光實

8、時定量PCR及Western-blot方法,對在UPR中發(fā)揮重要作用的靶基因GRP78/BiP和XBP-1兩種同源異構(gòu)體(XBP-1u、XBP-1s)在硼替佐米作用不同時相(0h、4h、12h、24h)的表達情況進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的骨髓瘤細胞系對BZ敏感性差異顯著,KM3、RPM18226和NCI-H929的IC50分別為420.3073nM、129.083nM和70.913nM。熒光實時定量PCR結(jié)果顯示三個MM細胞系中,BiP-

9、mRNA水平均隨作用時間逐漸上升,12h達到高峰,在KM3、RPM18226和NCI-H929中分別由0.209±0.024上升至0.350±0.015(p<0.05)、0.365±0.124上升至2.175±0.175(p<0.05)、0.324±0.016上升至2.235±0.355(p<0.05),BiP-mRNA表達水平在BZ作用后顯著上升。BiP蛋白表達水平亦均隨作用時間逐漸上升,24h達到高峰,在KM3、RPM18226和N

10、CI-H929中BiP蛋白表達量分別為基礎(chǔ)表達量的0.92～1.73、1.46～2.68、1.17～1.80倍,但差異不顯著。BZ處理后4h XBP-1u-mRNA即明顯增加,而XBP-ls mRNA則顯著下降；對XBP-1u/XBP-1s比值進行了標化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BZ處理后4h XBP-1u/XBP-1s比值顯著上升,在KM3、RPM18226和NCI-H929中分別由基礎(chǔ)比值1.22±0.04上升至8.17±2.03(p<0.05)、

11、5.64±2.00上升至34.23±10.03(p<0.05)、3.10±0.24上升至7.56±1.76(p<0.05)。Westem-blot結(jié)果顯示BZ處理前后XBP-1總蛋白表達水平無顯著變化,在KM3、RPM18226和NCI-H929中XBP-1總蛋白表達量分別為基礎(chǔ)表達量的0.76±1.23、0.77～1.43、0.70～1.41倍。 二、以人MM細胞系NCI-H929、RPMl8226、KM3和LP-1作為研究對

12、象,采用實時定量PCR方法檢測低劑量(終濃度0.5μmol/L)作用48h和72h時PRDM1α和PRDM1β的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)低劑量2ME2處理后,在4個骨髓瘤細胞系中均出現(xiàn)PRDM1基因表達上調(diào),通過與內(nèi)參GAPDH的拷貝數(shù)進行標化,發(fā)現(xiàn)兩種同源異構(gòu)體的表達水平隨著2ME2的作用時間均有不同程度的增加,并且α/β比值隨著2ME2的作用時間顯著上升,在NCI-H929、RPM18226、KM3和LP-1中分別由基礎(chǔ)比值1.461±0

13、.033上升至作用72h時的2.663±0.38 1(p<0.01)、1.929±0.334上升至2.727±0.362(p<0.05)、1.471±0.012上升至4.367±0.243(p<0.001)、1.660±0.042上升至3.05±0.167(p<0.001)。 結(jié)論： 一、不同的骨髓瘤細胞系對BZ敏感性不同,MM細胞內(nèi)產(chǎn)生的需要ER處理的分泌性免疫球蛋白愈多,對于PI造成的ERAD受阻就越敏感,細胞內(nèi)UP

14、R程度就愈高,就更易于發(fā)生凋亡,細胞內(nèi)錯誤折疊蛋白量與其對PI的敏感性成正相關(guān)。對于不分泌型MM細胞,上述機制不發(fā)揮作用,對于BZ的敏感性較差。 二、分子伴侶(Chaperon)作為細胞保護性的UPR蛋白,在UPR激活時轉(zhuǎn)錄、翻譯水平增加,幫助未折疊或錯誤折疊蛋白正確地折疊與組裝。BZ通過阻斷UPR中的ERAD提高MM細胞內(nèi)ER壓力,激活了UPR,但BZ增加MM細胞內(nèi)ER壓力的同時分子伴侶的表達量僅略微上升,與基礎(chǔ)表達水平并無顯

15、著差異。漿細胞作為專業(yè)性分泌細胞,ER固有的伴侶分子的組成性高表達是其特征,是其發(fā)揮正確地組裝、分泌免疫球蛋白這些生理功能所必需的。漿細胞內(nèi)細胞保護性的UPR蛋白--伴侶分子的表達量可能已經(jīng)接近最大化,因此任何額外的ERS并不能使其進一步顯著增加。 三、XBP-1是UPR的關(guān)鍵靶基因,PI不但可以從源頭上阻止具有轉(zhuǎn)錄活性的XBP-1s的產(chǎn)生,而且可以通過穩(wěn)定XBP-1u蛋白來負性調(diào)節(jié)XBP-1s的功能。XBP-1激活后其下游靶基

16、因如伴侶分子等對細胞具有保護作用,PI通過抑制XBP-1激活阻止UPR對腫瘤細胞的保護作用。 四、PI-方面通過抑制ERAD增加了惡性漿細胞內(nèi)的ERS,激活了UPR；另-方面通過抑制XBP-1的激活阻止UPR中對細胞生存有利的下游靶基因的激活,解除了UPR對細胞保護的一面,使細胞內(nèi)UPR程度升高激活凋亡通路。這可能是除了抑制NF-κB以外PI發(fā)揮抗骨髓瘤活性的另一個重要機制。 五、低劑量2ME2誘導骨髓瘤細胞發(fā)生分化的同