未折疊蛋白反應對化療藥物誘導乳腺癌細胞凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　1、探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)對人乳腺癌細胞凋亡的影響。
　　2、檢測順鉑(cisplatin，CDDP)、阿霉素(adriamycin,ADR)對MDA-MB-231細胞及C3H小鼠移植性乳腺癌ERS的激活作用以及對Caspase-4/Caspase-12介導的細胞凋亡途徑的影響。
　　3、探討利用SiRNA干擾技術阻斷UPR，對CDDP和ADR所致

2、MDA-MB-231細胞凋亡的影響。
　　方法：
　　一、體外實驗：
　　1、用衣霉素(Tunicamycin,TM)(3μmol/L)、CDDP(10 mg/L)、ADR(1mg/L)，處理MDA-MB-231細胞不同時間(0、6、12、24、36 h),Western blot檢測葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78，GRP78)的表達。
　　2、用CDDP、ADR處理M

3、DA-MB-231細胞48 h后，用溴化丙啶(propidium iodide， PI)染色，流式細胞儀(FCM)檢測細胞凋亡率。
　　3、用CDDP、ADR處理MDA-MB-231細胞不同時間(0、6、12、24、36 h)，按Caspase-4活性檢測試劑盒使用說明收集細胞并檢測Caspase-4活性。
　　4、SiRNA干擾GRP78合成阻斷UPR，再用CDDP、ADR處理MDA-MB-231細胞，檢測細胞凋亡率和Ca

4、spase-4活性的改變。
　　二、體內(nèi)實驗
　　1、C3H小鼠自發(fā)性乳腺癌為瘤源制成細胞懸液，調(diào)細胞濃度為2×107/ml接種于無瘤C3H小鼠，隨機分組。第9天起，每組分別給予生理鹽水NS、ADR、CDDP腹腔注射，每3天給藥一次，每3天測量腫瘤長短徑1次，繪制腫瘤生長曲線，第21天處死小鼠，稱量腫瘤重量，計算抑瘤率。
　　2、取腫瘤組織，提取蛋白，定量后Western blot檢測GRP78及Caspase-12的

5、表達。
　　3、腫瘤組織做常規(guī)石蠟包埋、切片并做HE染色，置顯微鏡下觀察其病理表現(xiàn)。
　　4、腫瘤組織用免疫組化法檢測處理組與非處理組中GRP78的表達。
　　結果：
　　一、體外試驗
　　1、CDDP和ADR對MDA-MB-231細胞中GRP78表達和細胞凋亡的影響。
　?。?）CDDP和ADR上調(diào)GRP78的表達（P﹤0.01）。
　?。?）CDDP和ADR誘導MDA-MB-231細胞凋亡，

6、凋亡率﹤30％。
　　（3）CDDP和ADR對Caspase-4的誘導呈先上升后下降的趨勢，而對GRP78的誘導則呈線性上升趨勢。
　　2、SiRNA干擾GRP78的合成對CDDP、ADR誘導MDA-MB-231細胞凋亡的影響。
　?。?）GRP78SiRNA轉(zhuǎn)染，增加CDDP和ADR誘導的細胞凋亡率（P﹤0.01）。
　?。?）GRP78SiRNA轉(zhuǎn)染增加Caspase-4的活性，取消Caspase-4活性的下

7、降相，并使其呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢。
　　二、體內(nèi)試驗
　　1、CDDP和ADR對C3H小鼠移植性乳腺癌細胞的生長具有明顯的抑制作用，第21天測量移植腫瘤體積分別為：NS組1690.89±42.94 mm3，CDDP組549.78±20.87 mm3，ADR組750.18±64.64 mm3。與NS組比較，CDDP組和ADR組腫瘤體積明顯減小，抑瘤率分別為60.48%、58.55%（P﹤0.01）。
　　2、HE染色組織病理

8、學檢查顯示CDDP組、ADR組細胞大小不一，核質(zhì)深染，可見點狀壞死灶及大片的無結構紅染壞死表現(xiàn)。
　　3、免疫組化結果顯示，CDDP組和ADR組中GRP78表達呈現(xiàn)強陽性，NS組中表達較弱。
　　4、腫瘤組織提取蛋白Western blot檢測GRP78表達，與NS組比較，CDDP組和ADR組GRP78表達明顯增強（P﹤0.01）。檢測Caspase-12的表達，與NS組比較，CDDP組和ADR組Caspase-12表達明顯

9、減弱（P﹤0.01）。
　　5、Caspase-12的Western blotting結果顯示CDDP和ADR處理組動物腫組織的Caspase-12的表達明顯降低（P﹤0.01）。
　　結論：
　　1、CDDP、ADR體外可誘導MDA-MB-231細胞，體內(nèi)可誘導C3H小鼠移植性乳腺癌細胞產(chǎn)生ERS、UPR和GRP78的高表達。
　　2、干擾腫瘤細胞GRP78的表達可增強CDDP、ADR的抗腫瘤作用。二者聯(lián)用可上